Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Особенности получения белкового комплекса вегетативных культур Bacillus anthracis для протеомного картирования штаммов

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-4-5

Полный текст:

Аннотация

Введение. Исследование белкового состава возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis позволяет выявлять как общие видовые характеристики, так и индивидуальные особенности штаммов, различающихся по фенотипическим свойствам, проявляющимся в основном в вегетативной форме и имеющим важное значение для вирулентности, иммуногенности и способности адаптироваться к разным условиям вегетирования.
Цель работы — на группе штаммов B. anthracis, имеющих разный плазмидный состав и вирулентность, апробировать разные способы экстракции тотального протеома из вегетативных клеток бацилл.
Результаты. Показано, что скорость спорообразования значительно варьирует между отдельными штаммами B. anthracis и может оказать существенное влияние на эффективность экстракции и состав белкового комплекса. Предварительная обработка лизоцимом, влияющим на клеточную оболочку, способствует более полному лизису клеток, а ультрамикроцентрифужная фильтрация обеспечивает полную специфическую стерильность полученных образцов.
Заключение. Разработана схема подготовки культур B. anthracis, позволяющая получать культуру в вегетативной фазе жизненного цикла и эффективно экстрагировать белки в сочетании с надежным обеззараживанием образцов.

Введение

Изучение протеома патогенных микроорга­низмов является актуальной задачей, т.к. позволя­ет не только выявить основные и вспомогательные факторы вирулентности, но и объективно оценить их продукцию в конкретных условиях культивиро­вания в лабораторных условиях или при естествен­ной циркуляции в организме животных и человека и во внешней среде. Исследование белкового соста­ва возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis позволяет определить как общие видовые характе­ристики, так и индивидуальные особенности штам­мов, различающихся по фенотипическим свой­ствам, проявляющимся в основном в вегетативной форме и имеющим важное значение для вирулент­ности, иммуногенности и способности адаптиро­ваться к разным условиям вегетирования.

Для объективной оценки особенностей протеомов штаммов B. anthracis необходимо, чтобы источником выделения белкового комплекса яв­лялась чистая культура с однородной по основ­ным фенотипическим признакам популяцией. Не менее важным условием качественной пробоподготовки является нахождение культуры в одной морфофункциональной фазе, т.к. при работе с воз­будителем сибирской язвы формирование спор вле­чет изменение белкового состава культур, что мо­жет приводить к некорректным результатам сравни­тельного анализа белковых комплексов штаммов, различающихся по скорости спорообразования. Так, около половины проб вегетативных культур пред­ставителей группы Bacillus cereus при исследовании масс-спектрометрическим методом имеют пики, ха­рактерные для спектров споровых форм [1][2]. Непосредственно метод лизиса культуры должен быть эффективным по отношению к культурам, имеющим особенности состава и строения поверхностных кле­точных структур, для наиболее полного извлечения белков и предусматривать их защиту от деградации, в том числе под действием собственных протеаз.

Полученный на конечном этапе материал дол­жен включать весь спектр белков, присущих микро­организму в конкретных условиях, в концентрации, достаточной для проведения протеомных исследо­ваний, и не содержать жизнеспособных клеток ми­кроорганизмов.

Цель работы — разработка алгоритма получе­ния и эффективной экстракции белкового комплек­са вегетативных культур B. anthracis, отвечающего требованиям режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.

Материалы и методы

В работе использовали вакцинные штаммы B. anthracis СТИ, 228/8, Steme 34F2, 55, СТИ-ПР, 71/12, Ихтиман, вирулентные штаммы 140 П, 228, 1265, 1(СО) и 81/1, а также их культуральные ва­рианты ΔСТИ, СТИ-II, ΔSteme 34F2, 228/8-II, 228/4, 1(СО)-5-1, 1(СО)-16, 1(СО)-23, 1(СО)-24, которые различались по генетическим характеристикам (все варианты плазмидного состава, различные MLVA- и SNP-генотипы) и по фенотипическим признакам: культурально-морфологическим свойствам, токсинопродукции, ферментативной активности, усло­виям формирования капсулы, вирулентности, чув­ствительности к специфическим сибиреязвенным бактериофагам.

В качестве питательных сред использовали LB-бульон и LB-агар (по Ленноксу), а при необхо­димости добавляли кровь (5%), сыворотку крови (10%), глицерин (4%).

Спорообразование контролировали визуально в мазках, окрашенных по Ребигеру, приготовленных из культур на различных этапах культивирования. Подсчитывали долю бациллярных клеток, содержа­щих формирующиеся споры, и отмечали наличие внеклеточно расположенных спор.

Процесс пробоподготовки включал предвари­тельную обработку клеток лизоцимом, разрушаю­щим клеточную стенку, в конечной концентрации 40 мг/мл с инкубацией 1 ч при 37°С. Далее образ­цы дважды отмывали в 40 hM растворе основно­го Трис-буфера от лизоцима и клеточного дебриса. Экстракцию тотального протеома проводили парал­лельно для каждого образца в 2 лизирующих буфе­рах: 8 М мочевина/2 М тиомочевина и 6 М гуани­дина тиоцианат. Для предотвращения деградации экстрагируемых белков в лизирующий буфер вно­сили ингибиторы бактериальных протеаз в концен­трации 1 мкг/мл. Обеззараживание проб проводили методом ультрамикроцентрифужной фильтрации лизата через фильтр PVDF с размером пор 0,22 мкм. Специфическую стерильность полученного мате­риала подтверждали отрицательными результатами высева на LB-агар.

Характер воздействия лизирующих буферов оценивали визуально по состоянию культуры в окрашенных мазках на различных этапах подго­товки материала. Сравнительную оценку полноты экстракции белкового комплекса из бациллярных клеток осуществляли по количеству и интенсивно­сти белковых полос, полученных при одномерном электрофоретическом разделении образцов на ав­томатической системе капиллярного электрофореза «Experion» («Bio-Rad») с использованием набора «Experion Pro260 Analysis Kit» («Bio-Rad») после предварительной очистки образцов набором «Ready Prep 2-D Cleanup Kit» («Bio-Rad»).

Двумерный электрофорез проводили с исполь­зованием комплекта оборудования для протеомных исследований («Bio-Rad») и специализированно­го программного обеспечения «Quantity One 1-D analysis software» и «PDQuest 2-D analysis software». Концентрацию образцов перед проведением 1-го направления измеряли на флюориметре «Qubit» и параллельно методом Бредфорда. Изоэлектрофо­кусировку проводили с использованием стрипов «ReadyStrip IPG strips» pH 3-10, 7 см, загружая об­разцы из расчета 10-15 мкг белка на 300 мкл регидратационного буфера. Уравновешивание стри­пов осуществляли в буфере с 6 М мочевиной в два этапа: с 2% дитиотреитолом и 2,5% йодацетамидом по 15 мин. Второе направление проводили в камере «Mini Protean» с охлаждением 10°C в 12% ПААГ в течение ~1,5 ч. Готовые гели окрашивали серебром с использованием набора «Silver Stain Plus».

За основу взяли методику, описанную в рабо­тах [3][4][5][6], с авторскими модификациями, включаю­щими предварительную обработку культуры лизо- цимом, а также различные варианты состава лизи- рующих буферов. Посев вегетативной культуры для дальнейшего исследования протеомными методами проводили в несколько этапов, чтобы минимизиро­вать образование спор: первоначальный посев на LB-агар (20 ч) для отбора изолированных колоний и пересева в LB-бульон (18 ч) с последующим пере­севом на LB-агар (18 ч). Схема опыта представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема опыта по подбору оптимальных условий экстракции тотального протеома штаммов B. anthracis.

Fig. 1. An experimental design for selecting optimal extraction conditions for a total proteome of B. anthracis strains.

 

Результаты

На мазках, приготовленных из культуры на последнем этапе, выявили значительные разли­чия скорости спорообразования изученных куль­тур. Так, у штаммов B. anthracis 55, СТИ, СТИ-II, СТИ-ПР, 228/8-II, 228/4, ΔSteme, 140-П, 1265, 81/1, 228/8, Ихтиман, 71/12, 1(СО), 1(СО)-5-1 наблюдали 2-30% бактериальных клеток, содержащих споры на различных этапах формирования (рис. 2, а). В то же время у штаммов Steme 34F2 и ΔСТИ достаточ­но сформированные споры наблюдались в 82-88% бактериальных клеток, а у штамма ΔСТИ они рас­полагались свободно вне бацилл (рис. 2, б, в).

 

Рис. 2. Различия в спорообразовании на LB-агаре 20-часовых культур штаммов B. anthracis ΔSterne (а), Sterne 34F2 (б) и ΔСТИ (в), а также 6-часовой культуры штамма Sterne (г). Окраска методом Ребигера, ув. 500.

Fig. 2. Differences in spore formation on LB agar of 20-hour cultures of B. anthracis ΔSterne strains (a), Sterne 34F2 (b) and ΔSTI (c), as well as a 6-hour culture of Sterne strain (d). Coloring with the Rebiger method, *500.

 

На следующем этапе работы попытались до­биться отсутствия спор в культурах путем добав­ления в LB-агар добавок, тормозящих процесс спо­рообразования — глицерина, дефибринированной крови и инактивированной сыворотки крови, а так­же путем изменения сроков инкубирования культур. Для этого были выбраны штаммы B. anthracis 55, Steme 34F2, ΔСТИ с различной скоростью спорооб­разования. Использовали жидкую и плотные пита­тельные среды на основе LB-бульона: LB-бульон, LB-агар, LB-агар с добавлением 5% дефибринированной крови, LB-агар с добавлением 4% глицери­на. Споры засевали в LB-бульон и оставляли на 6 ч при 37°С, после чего культуру пересевали в новую порцию LB-бульона и помещали на 18 ч при 37°С. На следующий день 18-часовую бульонную культу­ру высевали пипеткой на плотные питательные сре­ды и распределяли по всей поверхности шпателем, инкубировали 6 ч при 37°С. После этого из культу­ры готовили взвесь и оставляли при -20°С на ночь. На всех этапах пересевов и приготовления взвеси готовили мазки для контроля спорообразования. При таких сроках выращивания в окрашенных маз­ках ни у одного из штаммов на всех средах споры не обнаруживались (рис. 2, г). Учитывая, что куль­тура предназначается для исследования особенностей протеомного комплекса различных штаммов, а также возможность экстракции белков крови или сыворотки при смывании культуры с поверхности среды, которые в дальнейшем могут искажать кар­тину белкового спектра культур, получаемую мето­дом 2D-электрофореза, вероятно, предпочтительнее использовать на последнем этапе пересевов культур LB-агар без добавок.

При использовании метода 2D-электрофореза важным фактором эффективной подготовки мате­риала является полнота извлечения белкового ком­плекса из бациллярных клеток. Для разрушения бактериальных клеток и экстракции внутриклеточ­ного белкового комплекса использовали лизирующие буферы, содержащие хаотропные вещества (гуанидина тиоцианат, мочевина, тиомочевина), раз­рушающие мембранные структуры, поверхностно активные вещества, способствующие максималь­ному извлечению белков, восстановитель, способ­ный восстанавливать структуру белковых молекул, нарушенную денатурирующим действием хаотропных веществ, и коктейль ингибиторов протеаз, пре­дотвращающий деградацию белков под действием внутриклеточных протеаз. Далее в работе исполь­зовали взвеси 20-часовых культур авирулентных штаммов B. anthracis СТИ, 228/8, Steme 34F2, 55, СТИ-ПР, 71/12, Ихтиман, вирулентных — 140 П, 228, 1265, 1(СО) и 81/1, а также их культуральных вариантов ΔΟΜ, СТИ-II, ΔSteme 34F2, 228/8-II, 228/4, 1(СО)-5-1, 1(СО)-16, 1(СО)-23 и 1(СО)-24.

Культуры всех штаммов после обработки лизо- цимом образовывали конгломераты слабоокрашенных бациллярных клеток в виде комочков, за исклю­чением штаммов B. anthracis 1(СО)-23 и 1(СО)-24, которые сохраняли длинные цепочки. Результаты микроскопии мазков на различных этапах выяви­ли некоторые особенности у отдельных штаммов. Исходная 20-часовая культура штамма B. anthracis ΔСТИ содержала уже вполне сформировавшиеся споры, в том числе расположенные внеклеточно, и практически полностью лизировалась при всех вариантах обработки лизирующими буферами в сочетании с лизоцимом, в результате чего в мазках наблюдались свободно лежащие споры и детрит бактериальных клеток (рис. 3, г).

 

Рис. 3. Микрофотографии осадка бактериальных клеток штаммов B. anthracis после последовательной обработки лизоцимом и лизирующим буфером с 6 М гуанидина тиоцианатом: а — 1(СО); б — 1(СО)-5-1; в — 1(СО)-24; г — ΔСТИ. Окраска методом Ребигера, ув. 500.

Fig. 3. Microphotographs of the sediment of bacterial cells of B. anthracis strains after sequential treatment with lysozyme and lysis buffer with 6 M guanidine thiocyanate: a — 1(CO); b — 1(СО)-5-1; c — 1(СО)-24; d — ΔSTI. Coloring with the Rebiger method, *500.

 

После воздействия лизирующего раствора, содержащего 6 М гуанидина тиоцианата, на натив­ные (не обработанные лизоцимом) взвеси бацилл в мазках наблюдали характерные для штаммов B. anthracis цепочки клеток, окраска которых была менее интенсивной и неравномерной по сравнению с исходной культурой. Наименьшие изменения пре­терпевали штаммы B. anthracis 1(СО)-23 и 1(СО)-24.

При обработке бактериальных взвесей лизирующим раствором с 8 М мочевиной/2 М тиомо- чевиной видимые изменения культур были мини­мальными — окраска клеток становилась несколько слабее, а у штаммов 1(СО)-23 и 1(СО)-24 она прак­тически не менялась. Бациллы штамма 1(СО)-5-1 располагались в окружении вещества, аналогично­го по окраске капсульному.

Воздействие лизирующих растворов на ба­циллы, предварительно обработанные лизоцимом, приводило у большинства изученных штаммов к образованию бактериального детрита и слабоокра- шенных «теней» бактериальных клеток (рис. 3, а, б), штаммы 55, 71/12 сохраняли цепочки, в которых клетки прокрашивались значительно слабее натив­ной культуры, культура штамма 1(СО)-24 визуаль­но практически не менялась (рис. 3, в).

При оценке результатов экстракции белкового комплекса вегетативных культур B. anthracis наибо­лее эффективным методом оказывался лизис буфе­ром, содержащим 6 М гуанидина тиоцианат, после предварительной обработки лизоцимом.

Наибольшее количество белковых фракций выявляли в материале классического по феноти­пическим свойствам и плазмидному составу виру­лентного штамма B. anthracis 1(СО). На электрофо- реграмме у него наблюдалось наибольшее количе­ство полос, особенно в области 25-75 кД. Штамм B. anthracis 1(СО)-5-1, имеющий полный набор плазмид и обладающий способностью формиро­вать капсулу на обычных питательных средах, в том числе LB-агаре, в атмосфере воздуха, несмотря на наличие выраженного слоя капсульного вещества, демонстрировал большое количество белковых по­лос, которые были несколько менее интенсивно вы­ражены, в отличие от исходного штамма B. anthracis 1(СО). У остальных штаммов в области 50-75 кД наблюдалось меньшее количество полос, особенно у изогенных вариантов штамма B. anthracis 1(СО): 1(СО)-16 (нарушение прорастания спор при по­вышенном содержании СО2), 1(СО)-23 (бесплазмидный) и 1(СО)-24 (отсутствие плазмиды pXO1). Следует отметить, что указанные культуральные варианты штамма 1(СО) были выделены по при­знаку фагорезистентности к специфическим сиби­реязвенным бактериофагам. Меньшее количество белковых фракций штамма 1(СО) наблюдалось при обработке этим же лизирующим буфером нативной культуры: отмечалось некоторое (незначительное) снижение на электрофореграмме количества и ин­тенсивности линий, соответствующих белкам с мо­лекулярной массой 50-75 кД.

Экстракция белкового комплекса бацилл при воздействии лизирующего буфера, содержащего 8 М мочевину/2 М тиомочевину, была менее эффек­тивной именно в области белков с молекулярной массой более 50 кД; лизирующий эффект, как и в предыдущем случае, был более выражен при пред­варительной обработке культуры лизоцимом.

Описанные различия в эффективности экс­тракции бациллярных белков двумя лизирующими буферами с различными составами с предваритель­ной обработкой культуры лизоцимом и в ее отсут­ствие продемонстрированы на примере типичного вирулентного штамма B. anthracis 1(СО) (рис. 4).

 

Рис. 4. Разделение белков штамма B. anthracis 1(СО), выделенных лизисом культуры: 2 — раствором с гуани­дина тиоцианатом после обработки лизоцимом; 3 — тем же раствором без обработки лизоцимом; 4 — раствором с мочевиной/тиомочевиной после обработки лизоцимом; 5 — тем же раствором без обработки лизоцимом. 1 — маркер молекулярных масс белков.

Fig. 4. The separation of proteins of the strain B. anthracis 1(CO), isolated by culture lysis: 2 — a solution with guanidine thiocyanate after treatment with lysozyme; 3 — the same solution without treatment with lysozyme; 4 — a solution with urea/thiourea after treatment with lysozyme; 5 — the same solution without treatment with lysozyme. 1 — marker of molecular masses of proteins.

 

Поскольку разрешающая способность капил­лярного электрофореза недостаточно высока, этот метод может служить только для предварительной оценки образцов, полученных с применением раз­личных схем подготовки культуры и получения лизатов. На конечном этапе оценку эффективно­сти экстракции белков вакцинного штамма СТИ с невысокой скоростью спорообразования (13% при выращивании на LB-агаре в течение 20 ч) прово­дили методом 2D-электрофореза. На 2D-электро- фореграмме (рис. 5) зарегистрирован широкий набор белков, различающихся по значениям изоэ- лектрических точек (1-е направление) и величине молекулярных масс (2-е направление). Полученное разделение белков позволяет проводить их выделе­ние и идентификацию методом MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии после их экстракции из геля, очистки и трипсинолиза.

 

Рис. 5. Картина разделения белков штамма B. anthracis СТИ методом 2D-электрофореза. Экстракция белкового комплекса проводилась из взвеси 20-часовой культуры B. anthracis СТИ, предварительно обработанной лизоцимом, в лизирующем буфере с 6 М гуанидина тиоцианатом.

Fig. 5. Protein separation pattern of B. anthracis STI strain by 2D electrophoresis. The protein complex was extracted from a suspension of a 20-hour culture of B. anthracis STI, pretreated with lysozyme in lysis buffer with 6 M guanidine thiocyanate.

 

Обсуждение

Скорость спорообразования у штаммов B. anthracis значительно различается, что является зна­чимым фактором при соблюдении стандартных условий получения вегетативной культуры для протеомного картирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом 2D-электрофореза в соче­тании с методом MALDI-TOF/TOF масс-спектрометрии.

Анализ результатов различных методов экс­тракции тотального белкового комплекса выявил влияние индивидуальных свойств штаммов B. anthracis на эффективность различных способов пробоподготовки. Так, культура штамма ΔСТИ практи­чески полностью лизировалась под действием лизоцима, в то время как культурам штаммов B. anthracis 1(СО) и 1(СО)-5-1 для деструкции бактериальных клеток требовалось сочетанное действие лизоцима и лизирующих растворов, содержащих хаотропные вещества. Большую чувствительность штамма B. anthracis ΔСТИ, вероятно, можно объяснить особой физиологической фазой культуры — естественным лизисом бацилл, завершающим процесс спорооб­разования. Практически не измененный по сравне­нию с контролем (свежеприготовленная бактери­альная взвесь) вид культур после обработки лизи- рующими растворами подтверждает данные о том, что хаотропные вещества вызывают деградативные процессы, затрагивающие почти все клеточные структуры. Однако клеточная стенка в основном сохраняет свою целостность, ультраструктуру и ригидность, что обусловливает поддержание исход­ной морфологии клетки. В этих случаях, несмотря на визуальную целостность клеток, на электрофореграммах наблюдались интенсивные полосы, со­ответствующие белкам с различной молекулярной массой, хотя и в несколько меньшем количестве, чем при сочетанном воздействии лизоцима и гуани­дина тиоцианата.

Предварительная обработка культуры лизоцимом с последующей ее обработкой раствором, содержащим мочевину/тиомочевину, напротив, уменьшала количество белковых фракций на элек- трофореграмме, чему мы не смогли найти объясне­ние. Меньшая эффективность экстракции внутри­клеточных белков у штамма 1(СО)-24 испытанными методами, возможно, объясняется особенностями поверхностных структур клеток, т.к. данный штамм (вариант) был выделен из популяции исходного штамма 1(СО) по признаку резистентности к сиби­реязвенному бактериофагу ВА-9 и у него отсутству­ет плазмида pXO1.

Меньшее количество полос на электрофореграмме вряд ли можно объяснить отсутствием про­дукции части белков, синтез которых детермини­руется указанной плазмидой, т.к. бесплазмидный штамм ΔСТИ был представлен на электрофореграмме в этих же условиях значительно б0льшим количеством белковых фракций.

Заключение

Протеомное картирование штаммов B. anthra- cis является, безусловно, аналитическим методом их изучения для выявления индивидуальных осо­бенностей и их корреляции с патогенными свой­ствами или важными для жизнеобеспечения физио­логическими механизмами и сравнительного ана­лиза синтеза определенных белков в конкретных условиях. Исходя из этого, ввиду трудоемкости и затратности указанных исследований получение материала для дальнейшего анализа методом 2D- электрофореза должно проводиться с учетом ин­дивидуальных особенностей штаммов, в том числе скорости спорообразования и чувствительности к действию определенных лизирующих смесей, с подбором оптимальных питательных сред и сроков предварительного культивирования культуры, а так­же оптимальной схемы экстракции белков. Самым эффективным способом лизиса вегетативной культу­ры с целью получения наиболее полного комплекса белков является применение лизирующего буфера, содержащего 6 М гуанидина тиоцианата, с предвари­тельной обработкой лизоцимом.

Список литературы

1. Castanha E.R., Fox A., Fox K.F. Rapid discrimination of Bacillus anthracis from other members of the B. cereus group by mass and sequence of «intact» small acid soluble proteins (SASPs) using mass spectrometry. J. Microbiol. Methods. 2006; 67(2): 230-40. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mimet.2006.03.024

2. Lasch P., Beyer W., Nattermann H., Stämmler M., Siegbrecht E., Grunow R., et al. Identification of Bacillus anthracis by using matrix-assisted laser desorption ionization — time of flight mass spectrometry and artificial neural networks. Appl. Environ. Microbiol. 2009; 75(22): 7229-42. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.00857-09

3. Mottaz-Brewer H., Norbeck A., Adkins J., Manes N., Ansong C., Shi L., et al. Optimization of proteomic sample preparation procedures for comprehensive protein characterization of pathogenic systems. J. Biomol. Tech. 2008; 19(5): 285-95.

4. Chitlaru T., Shafferman A. Proteomic studies of Bacillus anthracis. Future Microbiol. 2009; 4(8): 983-98. DOI: http://doi.org/10.2217/fmb.09.73

5. Gao Z., Wang Z., Zhang K., Li Y., Zhang T., Wang D., et al. Experimental validation of Bacillus anthracis A16R proteogenomics. Sci. Rep. 2015; 5: 14608. DOI: http://doi.org/10.1038/srep14608

6. Rajoria S., Sabna S., Babele P., Kumar R.B., Kamboj D.V., Kumar S., et al. Elucidation of protein biomarkers for verification of selected biological warfare agents using tandem mass spectrometry. Sci. Rep. 2020; 10(1): 2205. DOI: http://doi.org/10.1038/s41598-020-59156-3


Об авторах

Елена Анатольевна Котенева
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
к.б.н., зав. лаб. постгеномных технологий


Ольга Ивановна Цыганкова
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
д.м.н., врач-бактериолог лаб. бруцеллеза


Александр Васильевич Калинин
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
биолог лаб. постгеномных технологий


Иван Сергеевич Родионов
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
м.н.с. лаб. постгеномных технологий


Алена Владимировна Абрамович
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
м.н.с. лаб. постгеномных технологий


Виктория Юрьевна Щербакова
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
лаборант-исследователь лаб. постгеномных технологий


Просмотров: 79


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)