Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Доклинические исследования безопасности, иммуногенности и защитной активности аттенуированных бактерий Bordetella pertussis на экспериментальной модели Macaca mulatta

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-4-3

Полный текст:

Аннотация

Введение. Рост заболеваемости коклюшем среди разных групп населения и несовершенство существующих профилактических препаратов требуют разработки новых безопасных вакцин, удобных для иммунизации детей раннего младенческого возраста, реиммунизации подростков и взрослых.
Целью настоящей работы является характеристика безопасности, иммуногенности и защитной активности сконструированных нами аттенуированных бактерий Bordetella pertussis 4МКS в тесте интраназального заражения иммунизированных обезьян Macaca mulatta вирулентными бактериями возбудителя коклюша.
Материалы и методы. Для иммунизации и экспериментальной инфекции использованы 5 половозрелых, клинически здоровых обезьян Macaca mulatta в возрасте 3–4 лет. Реиммунизацию проводили через 6 мес. В качестве контроля использовали 3 неиммунизированных животных того же возраста.
Результаты. Интраназальная однократная и повторная инокуляции аттенуированных бактерий B. pertussis не вызывали воспалительных процессов в носоглотке обезьян Macaca mulatta и изменений лабораторных показателей крови, наблюдаемых после экспериментальной инфекции нечеловекообразных приматов вирулентными бактериями. Не зарегистрировано увеличения количества общих IgE в сыворотке крови обезьян Macaca mulatta после однократной и двукратной иммунизации. Интраназальная иммунизация обезьян Macaca mulatta аттенуированными и вирулентными бактериями B. pertussis приводит к формированию защитной реакции организма на повторную инфекцию, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их элиминации из носоглотки животных и развитии гуморального иммунного ответа на инфекцию. Развитие иммунитета к повторной коклюшной инфекции сопровождается выраженным бустерным эффектом.
Обсуждение. Представленные результаты указывают на общие механизмы формирования поствакцинального иммунитета в результате интраназальной вакцинации животных и постинфекционного противококлюшного иммунитета, обеспечивающих защиту от повторного инфицирования бактериями B. pertussis и развития клинических симптомов коклюша.

Введение

Несмотря на массовую противококлюшную вакцинацию, проводимую в разных странах с на­чала 1950-х гг., элиминации возбудителя коклюша среди населения не происходит. На фоне гиподиа­гностики коклюша ежегодно в мире регистрируется более 16 млн случаев заболевания разной степени тяжести, из которых около 200 тыс. заканчиваются летальным исходом [1]. В последнее десятилетие отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша среди подрост­ков и взрослых [2][3], распространение стертых форм заболевания, выявлены бессимптомные носительства бактерий Bordetella pertussis (ВР) [2][4][5].

В США, где охват детей прививками с коклюшной вакциной (КВ) составляет 95%, с начала 2000-х гг. отмечен значительный рост заболеваемости коклю­шем, приближающейся к довакцинному периоду [6][7]. Растет заболеваемость в Италии и Англии [8][9]. В России в 2018 г. зарегистрировано более чем 2-кратное увеличение числа случаев коклюша по сравнению с 2017 г. Тенденция роста заболе­ваемости сохранялась как в 2019 г., так и в начале 2000 г. [10]. В предыдущие годы рост заболеваемо­сти регистрировали главным образом в Москве и Санкт-Петербурге, что связано, вероятно, с качест­вом диагностики [11].

Для профилактики коклюша в настоящее время используют вакцины, содержащие корпускулярный коклюшный компонент (цельноклеточные КВ — ЦКВ) или бесклеточный коклюшный компонент (бесклеточные КВ — БКВ) в сочетании с инакти­вированными дифтерийным и столбнячным анаток­синами. Иногда ЦКВ или БКВ используют как моновакцины. Считается, что БКВ менее реактогенна, но прямые исследования на приматах показали, что она не обеспечивает антибактерийного иммунитета и не защищает животных от экспериментальной ко­клюшной инфекции [12]. На невысокую эффектив­ность ревакцинации подростков и взрослых БКВ указывает ее сравнительное определение заболе­ваемости вакцинированной и невакцинированной популяций [13][14].

Другим важным недостатком современных КВ является невысокая длительность сформиро­ванного иммунитета. Изучение эффективности КВ разного типа показало, что длительность поствак- цинального иммунитета не превышает 5 лет. После перенесенного заболевания иммунитет сохраняется до 10-15 лет [15].

Все современные КВ вводятся детям старше 2 мес не менее 3 раз. Таким образом, полный цикл вакцинации завершается не раньше чем к 6-месяч­ному возрасту ребенка, что сохраняет высокий риск в первые, самые опасные в отношении заболевания коклюшем, месяцы его жизни.

Рост заболеваемости коклюшем, в том числе среди старших детей и взрослого населения, при­вел к пониманию необходимости ревакцинации подростков и взрослых. Рассматривается необ­ходимость вакцинации матерей и формирования «семейного иммунитета» [3][4][16][17]. Для этих целей рекомендована только БКВ [4], которая, как упомянуто выше, не обеспечивает защиту детей и взрослых от заражения и распространения инфек­ции. Таким образом, приходится констатировать, что, несмотря на целесообразность ревакцинации подростков и взрослых, формирования семейного иммунитета, в настоящее время отсутствует вак­цина для этих целей. ЦКВ не рекомендована ВОЗ к применению у взрослых, а современная БКВ, ско­рее всего, неэффективна. БКВ продемонстрировала свою эффективность и безопасность в качестве аль­тернативы ЦКВ для вакцинации младенцев. Такая вакцинация контролирует смертность и тяжесть за­болевания детей младенческого, наиболее уязвимо­го для коклюша возраста. Однако, как и ЦКВ, она требует 3-4-кратной вакцинации и плохо защищает детей от инфицирования и заболевания при неза­вершенном цикле вакцинации.

В рамках доклинических исследований нами показаны безопасность интраназального введения аттенуированных бактерий BP 4МКS лаборатор­ным животным и защитный эффект вакцинации мышей в отношении их внутримозгового и интраназального заражения вирулентными бактериями BP [18]. Исследования последних лет продемонстрировали перспективность экспериментальной модели нечеловекообразных обезьян для изучения иммунобиологических характеристик возбудителя коклюша и иммуногенности КВ [19][20][21][22][23]. Показано, что экспериментальная инфекция обезьян приводит к развитию лабораторных показателей коклюшной инфекции, гиперемии носоглотки, длительной персистенции BP и нарастанию титра специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови животных. Исследования на павианах гамадрилах продемон­стрировали возможность передачи инфекции от че­ловека к обезьяне и между обезьянами [23].

Целью настоящей работы является характери­стика безопасности, иммуногенности и защитной активности сконструированных нами аттенуиро­ванных бактерий BP 4MKS в тесте интраназального заражения иммунизированных обезьян Macaca mulatta (макака резус; МР) вирулентными бактери­ями возбудителя коклюша.

Материалы и методы

BP культивировали на твердых питательных средах КУА с добавлением 10% дефибринированной крови барана при 36оС. Аттенуированные BP 4MKS из назофарингеальных смывов высевали на КУА, содержавшую 200 мкг/мл стрептомицина.

Для определения серотипового состава куль­туры использовали сыворотки диагностические ко­клюшные к агглютиногенам бактерий BP 1, 2, 3 ад­сорбированные, для реакции агглютинации, сухие (ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи) в соответствии с рекомендациями производителя.

Иммунизацию и экспериментальное инфици­рование проводили у 5 половозрелых, клинически здоровых МР в возрасте 3-4 лет. Реиммунизацию проводили через 6 мес. В качестве контроля ис­пользовали 3 неиммунизированных МР того же возраста. Работа с животными осуществлялась на базе Сухумского питомника обезьян (НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии). Использование животных соответствова­ло принципам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспе­риментальных и иных научных целей, а также тре­бованиям отечественных нормативных документов.

Защитную активность аттенуированных бакте­рий определяли по сравнению динамики выведения вирулентных бактерий BP 475 из носоглотки вак­цинированных и контрольных — неиммунизированных МР, развитию иммунологических реакций, а также клинических симптомов и лабораторных признаков коклюша.

Перед манипуляциями (иммунизацией, экс­периментальной инфекцией, взятием назофарин­геальных мазков) МР подвергали наркозу вну­тримышечным введением 0,03-0,04 мл золетила («Virbac», Франция) в концентрации 100 мг/мл (с премедикацией ксилазингидрохлоридом, 20 мг/мл). Экспериментальную инфекцию и вакцинацию (107­1010 бактерий) осуществляли путем введения 0,5 мл суспензии вирулентных или аттенуированных бак­терий в каждую ноздрю животного в положении ле­жа на спине.

Кровь на анализ у МР брали без наркоза с ис­пользованием «прижимных клеток».

Для выявления ДНК бактерий BP использован смыв назофарингеальных тампонов в 500 мкл фи­зиологического раствора. После центрифугирова­ния ДНК выделяли с помощью стандартной обра­ботки раствором гуанидинтиоцианата с последую­щей сорбцией на магнитном сорбенте («Promega»). Идентификацию ДНК бактерий BP проводили с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР в реальном времени [24][25].

Определение специфических к коклюшному токсину и филаментозному гемагглютинину IgG, IgM и неспецифических IgE в сыворотках крови МР после одно- и двукратной интраназальной вак­цинации проводили с применением тест-систем «Ridascreen». Неспецифические IgE определяли с помощью тест-системы «Вектор-Бест».

Результаты проанализированы по тесту Стьюдента. Различия значимы при р ≤ 0,05.

Результаты

Общее состояние МР и анализ крови после иммунизации и заражения вирулентными BP 475

Первая и повторная интраназальные иммуни­зации МР не привели к отклонениям от нормы в поведении, общем состоянии животных, формуле крови, количестве лейкоцитов и глюкозы, актив­ности аспартат- и аланинаминотрансферазы, к воз­никновению воспалительных или других реакций в носоглотке (табл. 1).

 

Таблица 1. Биохимический анализ крови МР после интраназальной иммунизации аттенуированными бактериями BP и экспериментальной инфекции вирулентными бактериями BP 475

Table 1. RMs' blood biochemistry after their intranasal immunization with attenuated BP bacteria and experimental infection with virulent BP 475 bacteria

Интраназальная инокуляция

Intranasal inoculation

Дни

Days

Аланинамино- трансфераза, Ед/мл

Alanine aminotransferase, U/ml

Аспартатамино- трансфераза, Ед/мл

Aspartate aminotransferase, U/ml

Глюкоза, Мм/л

Glucose, Mm/l

Лейкоциты, ×103

White blood cells, ×103

Первая иммунизация

First immunization

Фон

Background

34,5 ± 4,4

36,5 ± 12,5

5,4 ± 1,1

10,1 ± 2,8

 

3

38,8 ± 10,2

36,2 ± 10,4

4,7 ± 0,3

8,2 ± 1,9

 

7

42,1 ± 6,1

33,1 ± 2,6

5,5 ± 0,5

9,8 ± 2,7

 

14

46,1 ± 6,7

41,1 ± 10,6

4,7 ± 0,7

8,8 ± 2,3

Повторная иммунизация

Re-immunization

Фон

Background

39,1 ± 4,6

43,5 ± 11,5

4,4 ± 0,6

9,1 ± 2,6

 

3

37,2 ± 3,9

38,2 ± 8,4

4,7 ± 0,4

7,2 ± 1,9

 

7

40,0 ± 3,1

34,1 ± 5,6

5,3 ± 0,5

8,0 ± 3,1

 

14

41,8 ± 4,0

39,1 ± 7,1

4,7 ± 0,4

8,3 ± 2,5

Инфекция бактериями BP 475 нативных обезьян

Infection of native monkeys with BP 475 bacteria

Фон

Background

42,2 ± 6,4

42,0 ± 6,5

6,2 ± 0,3

12,1 ± 1,4

 

3

44,2 ± 4,9

39,2 ± 7,4

5,7 ± 0,7

17,8 ± 2,9

 

7

40,4 ± 4,1

41,1 ± 5,5

4,4 ± 0,6*

19,3 ± 2,9*

 

14

39,8 ± 3,8

40,1 ± 5,1

4,7 ± 0,4*

19,3 ± 2,9*

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с фоном.

Note. *p < 0.05 as compared to the background.

 

Экспериментальная инфекция иммунизиро­ванных обезьян вирулентными бактериями ВР че­рез 12 мес после реиммунизации также не выявила отклонений измеренных параметров от нормы (та­бл. 1). При этом в контрольном эксперименте, при заражении нативных обезьян вирулентными бакте­риями, зарегистрированы достоверное увеличение количества лейкоцитов и снижение содержания глюкозы (табл. 1), наличие слизи и воспаления но­соглотки на 3-10-е сутки инфекции. Кашля у кон­трольных и опытных обезьян не зарегистрировано.

Результаты измерений неспецифических IgE в сыворотке крови иммунизированных и инфициро­ванных животных представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Значения IgE в сыворотке крови МР, вакцинированных и ревакцинированных аттенуированными бактериями BP

Table 2. Values of IgE in blood sera of RMs vaccinated and re-vaccinated with attenuated BP bacteria

День после инфекции

Day after infection

Номер обезьяны

Monkey identification number

31881

31882

31883

31901

31908

31926

31927

31843

31870

31888

Первая иммунизация

First immunization

Фон

320

250

66

680

678

 

 

 

 

 

Background

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

290

190

73

-

-

 

 

 

 

 

14

285

220

56

845

693

 

 

 

 

 

24

427

350

48

690

578

 

 

 

 

 

64

469

191

53

662

750

 

 

 

 

 

180

668

117

63

609

555

 

 

 

 

 

Реиммунизация через 6 мес

Re-immunization in 6 months

Фон

668

117

63

609

555

 

 

 

 

 

Background

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

720

141

31

745

449

 

 

 

 

 

14

518

187

43

722

458

 

 

 

 

 

24

562

203

62

648

-

 

 

 

 

 

64

669

177

47

393

524

 

 

 

 

 

180

580

258

-

-

180

 

 

 

 

 

Заражение вирулентными бактериями BP

Infection with virulent BP bacteria

Фон

219

22

45

58

55

656

48

559

376

257

Background

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

73

13

15

45

32

732

37

635

281

201

14

48

13

17

10

14

651

25

759

351

224

28

43

7

9

23

9

515

52

569

390

356

Из табл. 2 видно, что из иммунизированных животных только у обезьяны 31883, а из контроль­ных — 31927 содержатся IgE в количестве, близком к значениям отрицательного контроля у человека (20-30 МЕ/мл). У всех обезьяны 31882 значения IgE варьируют от 117 до 350 ед., у остальных — 200-850 ед.

Не зарегистрировано регулярного увеличения количества IgE после их иммунизации и реимму­низации. Напротив, у обезьяны 31882 наблюдается тенденция к снижению количества IgE уже после реиммунизации, и у всех животных регистрируется значительное уменьшение числа IgE после зараже­ния вирулентными бактериями BP 475.

Бактериальная нагрузка BP в носоглотке обезьян после иммунизации и заражения вирулентными BP 475

Золотым стандартом для диагностики коклюша является бактериологический метод. Мы произво­дили высев материала смывов назофарингеальных тампонов, собранного с задней стенки носоглотки обезьян, на среду КУА с кровью, содержащую или не содержащую стрептомицин. Мазки брали через 1 ч после иммунизации или экспериментальной ин­фекции и далее в динамике через 3, 7, 10, 14 сут и т.д. Рост бактерий на среде КУА оценивали на 4-5-е сутки после посева. Выросшие колонии типировали с помощью специфических сывороток к агглютиногенам 1, 2 и Рост бактерий BP на чаш­ках удавалось регистрировать в течение первых 2 нед, в редких случаях — 3-4 нед после иноку­ляции. Дополнительную сложность представляло наличие посторонней микрофлоры, особенно при анализе материала на среде КУА без антибиотика. Поэтому, а также учитывая низкую эффективность метода бактериального посева, для диагностики коклюша и характеристики количества бактерий в ротоносоглотке животных использован разработан­ный нами метод ПЦР в реальном времени.

На рис. 1 и 2 представлена динамика изме­нения количества геном-эквивалентов бактерий в условном миллилитре смыва назофарингеального тампона (аспирата) обезьян, однократно и двукрат­но инфицированных вирулентными и аттенуиро­ванными бактериями BP.

 

Рис. 1. Динамика изменения количества геном-эквива­лентов бактерий BP в носоглотке МР после первого и повторного интраназального введения бактерий BP.

N — количество геном-эквивалентов бактерий BP в 1 мл назо­фарингеального аспирата. 1 — первое введение вирулентных бактерий BP; 2 — повторное введение вирулентных бактерий BP; 3 — первое введение аттенуированных бактерий BP; 4 — повторное введение аттенуированных бактерий BP; 5 — инфицирование вирулентными BP через 12 мес после введения аттенуированных бактерий BP.

Fig. 1. Changes in the number of BP genome-equivalents in the RMs' nasopharynx after the first and repeated intranasal vaccination with BP bacteria.

N — the number of BP genome-equivalents in 1 ml of the nasopharyngeal aspirate. 1 — the first vaccination with virulent BP bacteria; 2 — the repeated vaccination with virulent BP bacteria; 3 — the first vaccination with attenuated BP bacteria; 4 — the repeated vaccination with attenuated BP bacteria; 5 — the infection with virulent BP bacteria 12 months after the vaccination with attenuated BP bacteria.

 

Рис. 2. Динамика изменения количества геном-эквивалентов бактерий BP 18323 после 1-й и 2-й экспериментальной интраназальной инфекции МР.

1 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 107 КОЕ; 2 — 1-я эксперимен­тальная интраназальная инфекция в дозе 109 КОЕ; 3 — повторная экспериментальная инфекция BP 18323 в дозе 109-1010 КОЕ.

Fig. 2. Changes in the number of BP 18323 genome-equivalents after the 1st and 2nd experimental intranasal infection of RMs.

1 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 107 CFU; 2 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 109 CFU; 3 — repeated experimental infection with BP 18323 at a dose of 109-1010 CFU.

 

Повторную инокуляцию аттенуированных бак­терий BP проводили через 6 мес после 1-го введе­ния, а экспериментальную инфекцию вирулентны­ми бактериями BP — через 12 мес после реимму­низации.

Для прояснения зависимости картины элимина­ции от штамма бактерий и инфицирующей дозы про­ведено заражение половозрелых МР двумя дозами (107 КОЕ и 109-1010 КОЕ) вирулентных бактерий BP 18323. Каждой из доз интраназально инфицировали по 3 МР. Повторно всех МР инфицировали одной до­зой 109-1010 бактерий. Повторную эксперименталь­ную инфекцию вирулентными BP 475 или BP 18323 проводили через 4-6 мес после 1-й инокуляции. На рис. 1 и 2 видно, что число бактерий в носоглотке МР достигает максимума через 7-14 дней после экспери­ментальной инфекции аттенуированными бактерия­ми BP 4МКS (tmax = 7-14 дней), через 14-21 день по­сле инфекции изогенными вирулентными бактерия­ми BP 475 и через 7-10 дней после интраназальной инокуляции вирулентных бактерий BP 18323.

При посеве и ПЦР-анализе смывов назофарин­геальных тампонов контрольных животных роста колоний и регистрации ДНК возбудителя коклюша не наблюдали.

Титр специфических IgG в сыворотке крови вакцинированных обезьян МР после интраназального инфицирования BP

Все эксперименты, описанные в предыдущем разделе, сопровождались изучением динамики из­менения уровня специфических IgG к BP в сыво­ротке крови инфицированных животных. При 1-й экспериментальной инфекции количество специфи­ческих IgG в сыворотке крови животных нарастало (рис. 3, 4) начиная с 10-14-го дня и достигало мак­симума к 28-му дню у обезьян, инфицированных вирулентными и атенуированными бактериями BP 475, и к 35-48-му дню после инфекции BP 18323. После повторной инфекции бактериями BP 18323 IgG достигал максимального значения к 14-му дню после инокуляции бактерий любого штамма.

 

Рис. 3. Динамика изменения количества IgG в сыворот­ке крови МР после 1-го и повторного интраназального введения им бактерий BP.

По оси ординат — относительное значение количества IgG (в %): оПк+/ОД, где ОПК+ — значение оптической плотности положительного контроля, Oni — оптическая плотность в лунке с исследуемой сывороткой. 1 — 1-е введение аттенуированных бактерий BP; 2 — 1-е введение вирулентных бактерий BP; 3 — инфицирование вирулентными бактериями BP через 12 мес после введения ат­тенуированных бактерий BP; 4 — повторное введение вирулент­ных бактерий BP; 5 — повторное введение аттенуированных бактерий BР.

Fig. 3. Changes in the IgG level in the RMs' blood serum after the 1st and repeated intranasal vaccination with BP bacteria.

On the vertical axis — the relative value of IgG levels (%): ODC+/ODi, where ODC+ — optical density of the positive control, ODi — optical density in the well with the studied serum. 1 — the 1st vaccination with attenuated BP bacteria; 2 — the 1st vaccination with virulent BP bacteria; 3 — the infection with virulent BP bacteria 12 months after the vaccination with attenuated BP bacteria; 4 — the repeated vaccination with virulent BP bacteria; 5 — the repeated vaccination with attenuated BP bacteria.

 

 

Рис. 4. Динамика изменения относительного количества IgG в сыворотке крови МР после 1-й и повторной интраназальной инфекции животных бактериями BP 18323.

1 — 1-я экспериментальная интраназальная ин­фекция в дозе 107 КОЕ; 2 — 1-я экспериментальная интраназальная инфекция в дозе 109 КОЕ; 3 — повторная экспериментальная инфекция BP 18323 в дозе 109 КОЕ.

Fig. 4. Changes in the IgG relative levels in the RMs' blood serum after the 1st and repeated intranasal infection of the animals with Bp 18323 bacteria.

1 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 107 CFU; 2 — the 1st experimental intranasal infection at a dose of 109 CFU; 3 — the repeated experimental infection with BP 18323 at a dose of 109 CFU.

 

Обсуждение

Доклинические исследования острой токсич­ности на крысятах и мышатах, лейкоцитоз- и гиста- минсенсибилизирующей активности коклюшного токсина и весовой токсичности суспензии аттену­ированных бактерий BP в классических экспери­ментах на линейных мышах, активности дермоне­кротического эндотоксина и гипоаллергенности в экспериментах на кроликах и морских свинках продемонстрировали безопасность интраназаль- ного применения сконструированной нами живой рекомбинантной коклюшной вакцины (ЖКВ) [18].

Исследования, проведенные нами на поло­возрелых нечеловекообразных приматах, показали, что экспериментальная интраназальная инфекция обезьян вирулентными бактериями BP приводит к развитию лабораторных признаков коклюшной инфекции у обезьян МР, павиан гамадрил, макак яванский и макак японский [22]. У неполовозре­лых павианов анубисов развивался характерный для коклюша кашель [19]. Иммунизация павианов анубис ЖКВ на основе аттенуированных бактерий BP BPZE1 продемонстрировала ее безопасность и иммуногеность [21]. Эти результаты указывали на перспективность экспериментальной модели нече­ловекообразных обезьян для изучения иммунобио­логических характеристик возбудителя коклюша и иммуногенности коклюшных вакцин.

Представленные в настоящем исследовании результаты продемонстрировали отсутствие изме­нения показателей анализа крови и местных реак­ций у МР после интраназальной инокуляции атте­нуированных бактерий BP в полном соответствии с экспериментами на мелких лабораторных жи­вотных. После первой и повторной вакцинации не зарегистрировано воспалительных процессов в но­соглотке животных, наблюдаемых нами после экс­периментальной инфекции вирулентными бактери­ями. Не отмечено увеличения количества общих IgE в сыворотке крови обезьян после вакцинации и ре­вакцинации. У всех иммунизированных животных регистрировалось снижение IgE после заражения вирулентными бактериями BP 475. Эти наблюдения хорошо согласуются с результатами R. Li с соавт. [26], показавших, что интраназальная вакцинация мышей аттенуированными бактериями BP BPZE1 не только не вызывает аллергических реакций, но и защищает животных от экспериментального ал­лергического воспаления и снижает уровень IgE в сыворотке крови.

Следует отметить, что тест-система «IgE Ridascreen», предназначенная для работы с сыво­ротками крови человека, не выявляла IgE в сыворот­ке обезьян. Для регистрации IgE в сыворотке крови обезьян была использована тест-система «IgE Век- тор-Бест». Эта система не применялась ранее для оценки IgE обезьян, поэтому полученные цифры не могут быть использованы для количественного определения, но пригодны для качественной оцен­ки изменения содержания IgE после иммунизации животных.

Размножение вирулентных бактерий BP в но­соглотке и их персистенция в организме человека являются важными характеристиками коклюшной инфекции. Согласно имеющимся в настоящее вре­мя данным иммунизация обезьян ЦКВ и аттенуиро­ванными бактериями, в отличие от БКВ, приводит к формированию мукозального иммунитета, препят­ствующего размножению вирулентных бактерий BP при их проникновении в организм человека и обезьяны. Представленные на рис. 1 и 2 графики де­монстрируют схожую динамику размножения/эрадикации аттенуированных и вирулентных бактерий разных штаммов в рото-носоглотке МР. Отдельные геном-эквиваленты BP регистрируются в назофа­рингеальных изолятах с помощью ПЦР в реальном времени вплоть до 6 мес. Аналогичные результаты получены нами при обследовании выздоравливаю­щих от коклюша детей разного возраста, у 15-20% которых возбудитель коклюша регистрировали с помощью ПЦР в реальном времени спустя 6 мес после постановки диагноза [27].

Схожая картина наблюдалась после повтор­ной инокуляции аттенуированных и вирулентных бактерий обезьянам и после экспериментальной инфекции иммунизированных животных вирулент­ными бактериями. Кривые размножения/эрадикации после повторной инокуляции бактерий (рис. 1 и 2) не имеют качественных отличий, но принци­пиально отличаются от картины после 1-й инокуля­ции отсутствием накопления и значительно более быстрой эрадикацией бактерий. Например, к 28-му дню после повторной инфекции (иммунизации) бактерии не выявлялись или их удавалось реги­стрировать только в единичных копиях, тогда как в эти же сроки после 1-й инфекции число геном-экви­валентов бактерий BP могло составлять несколько десятков. Необходимо отметить, что чувствитель­ность использованной нами тест-системы составля­ет 0,01-0,1 геном-эквивалента в 5 мкл раствора и определяется применением многокопийной после­довательности IS481 в качестве мишени амплифи­кации [24][25].

Для изучения зависимости динамики размно­жения бактерий и развития иммунного ответа от инфицирующей дозы и штамма бактерий наряду с изогенными вирулентными и аттенуированны­ми бактериями BP 475 и 4МKS использованы ви­рулентные бактерии BP 18323, применяемые для определения защитной активности ЦКВ. Бактерии вводили 3 МР по 109-1010 КОЕ, 3 МР — по 107 КОЕ. Количество бактерий и динамика размножения/эрадикации после экспериментальной инфекции МР, получивших 109 бактерий, не имели статистически значимых отличий от динамики при инфицирова­нии животных другими штаммами BP. Измеренные нами значения t для BP 475, 18323 и 4МKS близки друг к другу и совпадают со значениями, приведен­ными в работе J.M. Warfel и соавт. [19] для бактерий BP D420, полученных при инфицировании детены­шей павиана анубиса.

При инфицировании обезьян дозой 107 КОЕ бактерий BP на протяжении всего времени развития 1-й инфекции наблюдали достоверно меньшее ко­личество геном-эквивалентов бактерий BP в носо­глотке животных (рис. 2). Это обстоятельство было учтено нами при определении вакцинирующей до­зы для клинических исследований ЖКВ на здоро­вых добровольцах, продолжающихся в настоящее время.

Следует отметить, что проведенные нами ра­нее исследования показали, что в процессе перси- стенции бактерий BP в организме обезьяны проис­ходит изменение фазового состава популяции. Если в первые часы после инфекции подавляющее боль­шинство бактерий BP находятся в вирулентном со­стоянии, характеризующемся нативной структурой оперона bvgAS, то в процессе развития инфекции гетерогенность популяции бактерий BP возрастает за счет увеличения доли авирулентных мутантов возбудителя коклюша, несущих инсерцию IS481 в опероне bvgAS BP. В наибольшей степени процесс выражен после повторных инокуляций, когда коли­чество инсерционных мутантов бактерий BP в персистирующей популяции может достигать 50% от числа зарегистрированных бактерий [28]. Это на­блюдение указывает на возможный механизм фор­мирования длительно персистирующих бактерий, обеспечивающих выживание патогена и его переда­чу новому хозяину.

На рис. 3 и 4 видно, что динамика изменения титра специфических IgG в сыворотке крови вакци­нированных обезьян, экспериментально инфициро­ванных вирулентными бактериями BP, близка к со­ответствующей кривой, полученной после повтор­ного инфицирования МР, и значительно отличается от динамики IgG после 1-й экспериментальной ин­фекции вирулентными и аттенуированными бакте­риями. У всех реиммунизированных и инфициро­ванных после иммунизации вирулентными бакте­риями BP животных количество антител быстро нарастало и достигало максимума к 10-14-му дню. Эти результаты полностью соответствуют результа­там определения IgG после повторного заражения вирулентными бактериями BP 475 и хорошо согла­суются с приведенными выше результатами изуче­ния динамики накопления бактерий в носоглотке инфицированных животных. Быстрое нарастание специфических антител после повторного контакта с инфекцией способствует подавлению размноже­ния бактерий и их элиминации из носоглотки жи­вотных.

Схожая динамика выявлена нами при 2- и 3-кратных экспериментальных заражениях разных видов обезьян Старого Света вирулентными бак­териями BP, в том числе в дозах 1010-1011 КОЕ. Во всех случаях зарегистрированы выраженный бу­стер гуморального иммунного ответа и ускоренная элиминация возбудителя после повторного зараже­ния [22]. Наличие бустерного эффекта повторной вакцинации при низких значениях и даже при от­сутствии IgG у некоторых животных после 1-й вак­цинации, а также ускоренная элиминация бактерий у всех животных после повторной вакцинации ука­зывают на то, что даже однократная интраназальная вакцинация аттенуированными бактериями может оказаться достаточной для обеспечения защиты от экспериментальной инфекции.

Таким образом, экспериментальная интраназальная инфекция МР аттенуированными и виру­лентными бактериями BP приводит к формирова­нию защитной реакции организма, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их элиминации из носоглотки животных и развитии гуморального иммунного ответа. Раз­витие гуморального, антительного ответа после повторной инфекции носит бустерный характер, независимо от штамма бактерий. Представленные результаты указывают на общие механизмы фор­мирования поствакцинального иммунитета после интраназальной иммунизации животных ЖКВ и постинфекционного противококлюшного иммуни­тета, обеспечивающих защиту от повторного ин­фицирования бактериями BP и развития клиниче­ских симптомов коклюша. Представленные данные не противоречат результатам C. Locht и соавт. [21], продемонстрировавшим наличие выраженного за­щитного эффекта в отношении экспериментальной инфекции вирулентными бактериями BP D420 у павианов анубисов, иммунизированных живыми атте­нуированными бактериями BP. Менее выраженным защитным эффектом обладают инактивированные бактерии возбудителя (ЦКВ), в то время как БКВ не обеспечивала защиты от размножения бактерий по­сле повторной инфекции [20][21].

Отсутствие специфичных для обезьян тест-си­стем иммуноферментного анализа (ИФА) значи­тельно осложняет регистрацию коклюшных анти­тел у этих животных. Если использованная нами тест-система ИФА IgG человека «Ridascreen» ока­залась пригодной для регистрации IgG у МР, павиа­нов гамадрилов, макак яванских и макак японских, то тест-система той же фирмы для IgA человека бы­ла совершенно не чувствительна к IgA обезьян. Нам удалось определить значения IgМ на разных сроках экспериментальной коклюшной инфекции обезьян с помощью тест-системы ИФА IgМ человека BP «Ridascreen», однако низкие абсолютные значения величин и большой разброс делают непродуктив­ным их обсуждение. Скорее всего, наблюдаемая картина объясняется недостаточной эффективно­стью коммерческой тест-системы на сыворотке обезьян. Полученные результаты указывают на не­обходимость конструирования тест-систем ИФА, специфичных для иммуноглобулинов нечеловеко­образных обезьян, в процессе дальнейшего исполь­зования этих животных в качестве эксперименталь­ной модели.

Заключение

Интраназальная однократная и повторная ино­куляции аттенуированных бактерий BP не вызывали воспалительных процессов в носоглотке МР и изме­нения лабораторных показателей крови, наблюдае­мых после экспериментальной инфекции нечелове­кообразных приматов вирулентными бактериями.

Не зарегистрировано повышения уровня об­щего IgE в сыворотке крови обезьян после и одно- и двукратной иммунизации.

Экспериментальная интраназальная инфек­ция МР аттенуированными и вирулентными бак­териями BP приводит к формированию защитной реакции организма, проявляющейся в подавлении размножения бактерий, ускорении темпов их эли­минации из носоглотки животных и развитии гумо­рального иммунного ответа. Развитие гуморально­го, антительного ответа после повторной инфекции носит бустерный характер, независимо от штамма бактерий.

Представленные результаты указывают на об­щие механизмы формирования поствакцинального иммунитета после интраназальной вакцинации жи­вотных и постинфекционного противококлюшного иммунитета, обеспечивающих защиту от повторно­го инфицирования бактериями BP и развития кли­нических симптомов коклюша.

Список литературы

1. Pertussis vaccines: WHO position paper – September 2015. Wkly. Epidemiol. Rec. 2015; 90(35): 433-60.

2. Wood N., McIntyre P. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention. Paediatr. Respir Rev. 2008; 9(3): 201-11. DOI: http://doi.org/10.1016/j.prrv.2008.05.010

3. Wiley K.E., Zuo Y., Macartney K.K., McIntyre P. Sources of pertussis infection in young infants: a review of key evidence informing targeting of the cocoon strategy. Vaccine. 2013; 31(4): 618-25. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.11.052

4. Pinto M.V., Merkel T.J. Pertussis disease and transmission and host responses: insights from the baboon model of pertussis. J. Infect. 2017; 74(Suppl. 1): S114-9.

5. DOI: http://doi.org/10.1016/S0163-4453(17)30201-3

6. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., Амелина И.П., Алексеев Я.И., Каратаев Г.И. и др. Распространенность стертых форм коклюша и анализ фазовых состояний бактерий Bordetella pertussis. Детские инфекции. 2010; 9(4): 19-22.

7. CDC. Pertussis epidemic – Washington, 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2012; 61(28): 517-22.

8. Rosewell A., Spokes P., Gilmour R.E. NSW Annual vaccinepreventable disease report, 2011. NSW Public Health Bull. 2012; 23(9-10): 171-8. DOI: http://doi.org/10.1071/NB12086

9. Gonfiantini M.V., Carloni E., Gesualdo F., Pandolfi E., Agricola E., Rizzuto E., et al. Epidemiology of pertussis in Italy: disease trends over the last century. Euro Surveill. 2014; 19(40): 20921. DOI: http://doi.org/10.2807/1560-7917.es2014.19.40.20921

10. Health Protection report. Confirmed pertussis in England and Wales: data to end – November 2012. Available at: http://webarchive.nationalarchives.gov.uk/20140505162355/http://www.hpa.org.uk/hpr/archives/2012/news5112.htm

11. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь–октябрь 2018 г. М.; 2018.

12. Лобзин Ю.В., Харит С.М. Проблемы вакцинопрофилактики: краткая история, современное состояние и пути решения. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2014; (6): 30-7.

13. Warfel J.M., Zimmerman L.I., Merkel T.J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111(2): 787-92. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1314688110

14. Kilgore P.E., Salim A.M., Zervos M.J., Schmitt H.J. Pertussis: microbiology, disease, treatment, and prevention. Clin. Microbiol. Rev. 2016; 29(3): 449-86. DOI: http://doi.org/10.1128/CMR.00083-15

15. Chen Z., He Q. Immune persistence after pertussis vaccination. Hum. Vaccin. Immunother. 2017; 13(4): 744-56. DOI: http://doi.org/10.1080/21645515.2016.1259780

16. Guiso N., Njamkepo E., Vié le Sage F., Zepp F., Meyer C.U., Abitbol V., et al. Long-term humoral and cell-mediated immunity after acellular pertussis vaccination compares favourably with whole-cell vaccines 6 years after booster vaccination in the second year of life. Vaccine. 2007; 25(8): 1390-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vaccine.2006.10.048

17. Amirthalingam G., Andrews N., Campbell H., Ribeiro S., Kara E., Donegan K., et al. Effectiveness of maternal pertussis vaccination in England: an observational study. Lancet. 2014; 384(9953): 1521-8. DOI: http://doi.org/10.1016/S0140-6736(14)60686-3

18. Сёмин Е.Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю. и др. Конструирование рекомбинантных аттенуированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; (4): 33-41. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-33-4118.

19. Синяшина Л.Н., Семин Е.Г., Медкова А.Ю., Сюндюкова Р.А., Каратаев Г.И. Доклиническое исследование токсичности и безопасности кандидатной живой коклюшной вакцины интраназального применения. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(6): 98-108. DOI: http://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-98-108

20. Warfel J.M., Beren J., Kelly V.K., Lee G., Merkel T.J. Nonhuman primate model of pertussis. Infect. Immun. 2012; 80(4): 1530-6. DOI: http://doi.org/10.1128/IAI.06310-11

21. Warfel J.M., Zimmerman L.I., Merkel T.J. Comparison of three whole-cell pertussis vaccines in the baboon model of pertussis. Clin. Vaccine Immunol. 2015; 23(1): 47-54. DOI: http://doi.org/10.1128/CVI.00449-15

22. Locht C., Papin J.F., Lecher S., Debrie A.S., Thalen M., Solovay K., et al. Live attenuated pertussis vaccine BPZE1 protects baboons against B. pertussis. J. Infect. Dis. 2017; 216(1): 117-24. DOI: http://doi.org/10.1093/infdis/jix254

23. Кубрава Д.Т., Медкова А.Ю., Синяшина Л.Н., Шевцова З.В., Матуа А.З., Конджария И.Г. и др. Экспериментальный коклюш у обезьян. Вестник Российской академии медицинских наук. 2013; 68(8): 28-33.

24. Медкова А.Ю., Каратаев Г.И., Шевцова З.В., Матуа А.З., Семин Е.Г., Амичба А.А. и др. Эпизоотический очаг коклюша у обезьян вида Papio gamadryas. Журнал инфектологии. 2015; 7(3): 103-11. DOI: http://doi.org/10.22625/2072-6732-2015-7-3-103-111

25. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н., Амелина И.П., Алексеев Г.И., Боковой Я.И. и др. Выявление инсерционных мутантов авирулентных bvg-мутантов Bordetella pertussis у больных коклюшем, острой респираторной вирусной инфекцией и практически здоровых людей. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010; (4): 27-31.

26. Bidet P., Liguori S., De Lauzanne A., Caro V., Lorrot M., Carol A., et al. Real-time PCR measurement of persistence of Bordetella pertussis DNA in nasopharyngeal secretions during antibiotic treatment of young children with pertussis. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(11): 3636-8. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.01308-08

27. Li R., Cheng C., Chong S.Z., Lim A.R., Goh Y.F., Locht C., et al. Attenuated Bordetella pertussis BPZE1 protects against allergic airway inflammation and contact dermatitis in mouse models. Allergy. 2012; 67(10): 1250-8. DOI: http://doi.org/10.1111/j.1398-9995.2012.02884.x

28. Нестерова Ю.В., Медкова А.Ю., Бабаченко И.В., Сёмин Е.Г., Калисникова Е.Л., Синяшина Л.Н. и др. Клинико-диагностическое значение генетических маркеров Bordetella pertussis у контактных лиц в семейных очагах. Журнал инфектологии. 2019; 11(1): 17-24. DOI: http://doi.org/10.22625/2072-6732-2019-11-1-17-24

29. Каратаев Г.И., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю., Семин Е.Г., Шевцова З.В., Матуа А.З. и др. Инсерционная инактивация оперона вирулентности в популяции персистирующих бактерий Bordetella pertussis. Генетика. 2016; 52(4): 422-30. DOI: http://doi.org/10.7868/S0016675816030085


Об авторах

Алиса Юрьевна Медкова
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»; ФГБУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ
Россия

к.м.н., с.н.с. лаб. генетики бактерий 

зав. инфекционным детским отделением 



Людмила Николаевна Синяшина
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Россия
д.м.н., в.н.с. лаб. генетики бактерий


Астанда Арнольдовна Амичба
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Абхазия
м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии


Евгений Григорьевич Cемин
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Россия
н.с. лаб. генетики бактерий


Зинаида Всеволодовна Шевцова
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии; Абхазский государственный университет
Абхазия

д.м.н., г.н.с. лаб. вирусологии и иммунологии 

проф. каф. экспериментальной биологии и медицины 



Алиса Зауровна Матуа
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии; Абхазский государственный университет
Абхазия

к.б.н., зам. директора по научной работе, зав. лаб. иммунологии и вирусологии

доц. каф. экспериментальной биологии и медицины 



Ануш Ашотовна Джидарян
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Абхазия
ст. лаборант лаб. иммунологии и вирусологии


Дженни Тамазовна Кубрава
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Абхазия
м.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии


Ирина Георгиевна Конджария
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии; Абхазский государственный университет
Абхазия

к.б.н., с.н.с. лаб. иммунологии и вирусологии 

доц. каф. экспериментальной биологии и медицины 



В. С. Баркая
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Абхазия


Зураб Ясонович Миквабия
НИИ экспериментальной патологии и терапии Академии наук Абхазии
Абхазия
д.м.н., проф., директор


Геннадий Иванович Каратаев
ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Россия
д.б.н., в.н.с., рук. лаб. генетики бактерий


Просмотров: 144


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)