Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Характеристика маркеров холодовой адаптации кандидатных вакцинных штаммов для живых аттенуированных вакцин против ветряной оспы и опоясывающего герпеса

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-4-2

Полный текст:

Аннотация

Введение. Значимость ветряной оспы обусловлена ее широкой распространенностью, значительной вероятностью тяжелого клинического течения, осложнений, которые могут приводить к летальным исходам. Вакцинация является единственным специфическим способом профилактики заболевания. Цель работы заключалась в оценке аттенуации холодоадаптированных (ХА) кандидатных вирусных штаммов Varicella zoster и Herpes zoster традиционными и новыми методами.
Материалы и метод. В работе использовали штаммы диплоидных клеток легких и кожно-мышечной ткани эмбриона человека, первичные и диплоидные клетки фибробластов эмбриона морской свинки. Были получены два клинических изолята вируса — от ребенка, больного ветряной оспой, и взрослого в период реактивации опоясывающего герпеса. В качестве контроля использовали вакцинный штамм vOка и лабораторный штамм Ellen. Инфекционную активность вирусов определяли методом предельных разведений вируса в чувствительных культурах. Вирулентность устанавливали при анализе инфицированных вирусом Varicella zoster хорион-аллантоисных оболочек развивающихся куриных эмбрионов.
Результаты. Клинические изоляты пассированы при пониженной температуре и исследованы в сравнительных экспериментах на наличие биологических маркеров аттенуации. Установлено, что штаммы вируса Varicella zoster vFiraVax и вируса Herpes zoster vZelVax обладали температурочувствительностью и холодоадаптируемостью, но не вирулентностью. Аттенуированные ХА вирусные штаммы индуцировали более низкий уровень экспрессии α- и γ-интерфероновых рeцепторов на мононуклеарных клетках человека в отличие от их родительских вариантов.
Заключение. Нами созданы и охарактеризованы два кандидатных вакцинных штамма на основе аттенуации клинических изолятов.

Введение

Вирус Varicella zoster (VZV) является челове­ческим а-герпесвирусом и тесно связан с вирусом герпеса простого 1-го и 2-го типов. VZV имеет ти­пичную морфологию вируса герпеса, однако его ге­ном является самым небольшим среди а-герпесвирусов и он кодирует более 70 генных продуктов [1].

Ветряная оспа (ВО) имеет общую этиоло­гию и тесную патогенетическую связь с хрониче­ской формой инфекции — опоясывающим герпе­сом (ОГ), обусловленным вирусом Herpes zoster (HZV). ВО и ОГ являются разными клинически­ми формами одного инфекционного процесса. Риск развития ОГ у переболевших ВО составляет 10-30%. Среди лиц в возрасте 60-80 лет частота заболевания ОГ варьирует от 5 до 10 случаев на 1000 человек. У 15-40% больных ОГ развивается постгерпетическая невралгия, плохо поддающаяся лечению и приводящая к значительному сниже­нию качества жизни. Другие осложнения реакти­вации включают энцефалиты, моторную слабость, миелопатию и др. Наиболее тяжелые осложнения возникают у иммунокомпрометированных инди­видуумов [2][3][4].

За рубежом на протяжении многих лет приме­няется живая культуральная вакцина на основе ат­тенуированного вирусного штамма уОка (Япония). Эта вакцина создает длительный напряженный поствакцинальный иммунитет после двукратного цикла иммунизации (на 10-20 лет — период на­блюдения) и предотвращает смертельные исходы у новорожденных и детей с ослабленным иммуни­тетом, а также частично предотвращает развитие ОГ у пожилых людей и людей с ослабленным им­мунитетом [5].

На основе вакцинного штамма уОка произво­дится вакцина для иммунизации детей и взрослых. Доза вируса VZV в вакцине для взрослых увеличи­вается на 2 порядка.

Отечественные аналоги вакцины против ВО в России отсутствуют. В нашей лаборатории созданы два отечественных аттенуированных вакцинных штамма VZV для конструирования живых культу­ральных отечественных вакцин, предназначенных для детей и взрослых.

Основной целью настоящей работы является оценка аттенуированных вакцинных штаммов по традиционным биологическим маркерам аттенуа­ции и поиск новых маркеров аттенуации для более полного контроля свойств кандидатов в вакцинные вирусные штаммы для живой культуральной вакци­ны против ВО и ОГ.

Материалы и методы

Культуры клеток

В работе использовали штаммы диплоид­ных клеток легких эмбриона человека (ЛЭЧ-3 и MRC-5), штамм диплоидных клеток кожно-мы­шечной ткани эмбриона человека (КМ 27), первич­ные и диплоидные клетки фибробластов эмбрионов морской свинки (ФЭМС).

Диплоидные клеточные культуры выращива­ли на питательной среде ДМЕМ/F12 («PanEco») с 10 мМ HEPES, 5% эмбриональной телячьей сыво­ротки («HyClone») с добавлением 2 мМ глутамина и 40 мкг/мл гентамицина.

Вирусы

Получили клинический изолят VZV и клини­ческий изолят HZV от инфицированных пациентов в виде корочек от везикул, сформировавшихся с начала появления сыпи. Один изолят получили от здоровой девочки 6 лет, заболевшей ВО в Москве, другой — от мужчины 63 лет в период реактивации рецидивирующего ОГ.

Аттенуация клинических изолятов

Вирусный изолят ВО и ОГ аттенуировали на клетках ЛЭЧ-3 при низкой температуре (30°С). Изоляты прошли 12 пассажей на диплоидных клетках ЛЭЧ-3, 6 пассажей на первичных клетках ФЭМС и дополнительно 2 пассажа на клетках ЛЭЧ-3. После завершения полного цикла холодовой адаптации изоляту VZV присвоили название vFiraVax VZV, а изоляту HZV — vZelVax HZV.

В качестве референс-вирусов VZV использова­ли аттенуированный вакцинный вирусный штамм vОКА/Merсk VZV (США) и лабораторный вирус­ный штамм Ellen vZv (США).

Определение инфекционной активности вирусов VZV

Инфекционную активность вирусов опреде­ляли на клеточных культурах КМ-27 или ФЭМС, выращенных на 24-луночных планшетах. В под­держивающей питательной среде ДМЕМ с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) гото­вили 10-кратные разведения вируссодержащей жидкости (ВСЖ) с 10-1 до 10-10. Из планшетов с выросшими клетками ростовую среду удаляли и монослой клеток однократно промывали фосфат­но-буферным раствором (ФБР). По 0,1 мл каждого разведения ВСЖ вносили в центр лунки с клеточ­ным монослоем и оставляли на контакт при 36,5°С и 5% СО2 на 1 ч. После завершения контакта в ка­ждую лунку, включая лунки с контрольными клет­ками, вносили по 1 мл поддерживающей среды ДМЕМ с 2% ЭТС. Результаты титрования учиты­вали на 6-7-е сутки с момента инфицирования в реакции гемадсорбции с 0,25% взвесью эритроци­тов морской свинки или человека 0 группы Rh+. За титр вируса принимали максимальное разве­дение вируса, вызывающее гемадсорбцию в 50% инфицированных культур клеток, при отсутствии гемадсорбции в контрольных неинфицированных культурах клеток.

Заражение хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) развивающихся куриных эмбрионов

У 11-12-дневных куриных эмбрионов созда­вали искусственную воздушную полость, на нее наносили по 0,1 мл ВСЖ VZV. Ежедневно просма­тривали эмбрионы на жизнеспособность. В случае гибели эмбрионов на следующие сутки их уничто­жали. Наблюдали за эмбрионами в течение не более 6 сут. После охлаждения инфицированных эмбрио­нов из них извлекали ХАО на чашку Петри, обо­лочку отмывали ФБР и просматривали на наличие геморрагии или белых оспин.

Получение мышиных сывороток, специфичных к VZV

Мышей линии BALB/c, свободных от патоген­ной флоры (SPF-мыши), иммунизировали ВСЖ по 0,5 мл с 6 lg ГАДЕ50/0,1 мл (ГАДЕ — гемадсорбирую- щая единица) внутрибрюшинно трехкратно 3 дня подряд. Указанный цикл иммунизации повторяли трижды с 2-недельным интервалом.

Определение вирусспецифических антител в непрямом иммуноферментном анализе

В качестве VZV-сорбента на твердую фазу им­мунологического 96-луночного планшета («Nunk») сорбировали лизаты клеток КМ 27, инфицирован­ных лабораторным штаммом Ellen VZV. Лизаты инфицированных клеток получали путем зараже­ния монослоя клеток КМ 27, выращенных на куль­туральных флаконах площадью 175 см2 («Сostar») . Для инфицирования клеточного монослоя из куль­турального флакона удаляли ростовую среду, мо­нослой клеток дважды промывали ФБР и на кле­точный монослой вносили по 5 мл ВСЖ Ellen VZV с множественностью инфицирования 0,2. Культи­вирование инфицированных клеток проводили в инкубаторе в течение 10 сут при 36,5°С и 5% СО2. Затем из культуральных флаконов собирали ВСЖ, а в культуральный флакон с инфицированными клет­ками вносили по 5 мл ФБР, и культуральный флакон с инфицированными клетками трижды заморажива­ли при -70°С и размораживали при 4°С. В получен­ном инфицированном лизате, содержащем клеточно­ассоциированный VZV, на аппарате «NanoPhotometer NP80-Touch» определяли концентрацию белка.

После вортексирования инфицированный кле­точный лизат сорбировали на лунки 96-луночных планшетов по 50 мкл с концентрацией белка 5 мкг на лунку и высушивали в термостате при 36,5°С в течение 18-20 ч.

Постановку непрямого иммуноферментного анализа осуществляли по общепринятой методике: блокировка открытых связей 1% бычьим сыворо­точным альбумином на 0,01 М ФБР в термостате в течение 1,5 ч, удаление блокирующего раствора, титрование исследуемой сыворотки морской свин­ки с двукратным шагом в длинном ряду 96-луночного планшета, начиная с разведения 1 : 100 до 1 : 204 800. Связывание твердофазного антигена с иммунными сыворотками проходило в термостате в течение 1,5 ч. После завершения контакта планше­ты промывали трижды по 200 мкл на лунку 0,01 М ФБР с 0,05% Твин-20. Иммунные комплексы вы­являли с помощью конъюгата Protein A-Peroxidase («Sigma») в рабочем разведении 1 : 500 по 100 мкл на лунку в течение 1 ч в термостате. Далее план­шеты отмывали пятикратно 0,01 М ФБР с 0,05% Твин-20 и детектировали иммунные комплексы субстратным раствором тетраметилбензидина с пе­рекисью водорода в течение 15 мин в темноте. Ре­акцию останавливали 4N H2SO4. Оптическую плот­ность измеряли на фотометре «Bio-Rad 680» при длине волны 450 нм.

Определение экспрессии рецепторов для а- и у-интерферонов (ИФН) человека

Выделение лимфоцитов из венозной крови че­ловека 0 группы Rh+ и пробоподготовка для прямой реакции иммунофлюоресценции подробно описа­ны в работах [6][7]. Мононуклеарные клетки чело­века (МКЧ) выделяли из гепаринизированной кро­ви в градиенте фиколла при плотности 1,077 г/см3 («PanEco»). Полученные МКЧ ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 1% бычьего сывороточного аль­бумина, индуцировали антигенами VZV, культиви­ровали в инкубаторе при 36,5°С и 5% СО2 и в разные временные интервалы готовили образцы, индуци­рованные VZV МКЧ, для прямой реакции иммуно­флюоресценции. Приготовленные образцы окра­шивали ФИТЦ-конъюгатами на основе монокло­нальных антиидиотипических антител, структурно имитирующих α/β- и у-ИФН человека. Эти антиидиотипические антитела являются антирецепторными для ИФН-α/β и ИФН-у. После мечения маркерными препаратами их оценивали в люминесцентном ми­кроскопе «Optika» при длине волны 510-550 нм.

Получение гемагглютинина VZV по E. Norrby [8]

Для постановки реакции торможения гемаг- глютинирующей активности (РТГА) специфиче­ских анти-VZV-иммунных сывороток [8] получили гемагглютинин из ВСЖ Ellen VZV.

ВСЖ получали путем инфицирования куль­туры клеток Vero-CCL 81 лабораторным штаммом Ellen VZV. ВСЖ осветляли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 30 мин и обрабатывали Твин-80 и эфиром. Обработанный материал вновь центрифугировали при тех же условиях, в резуль­тате происходило расслаивание смеси. Гемагглютинирующий антиген находился в нижнем слое, который аккуратно отсасывали во флакон, закрыва­ли стерильной марлевой салфеткой и оставляли на ночь для освобождения от паров эфира. Для опре­деления титра вирусного гемагглютинина ставили реакцию гемагглютинации (РГА) со взвесью эри­троцитов морской свинки.

РГА применяли для выбора рабочего разведе­ния гемагглютинирующего антигена для постанов­ки РТГА. В основе последней лежала задержка гемагглютинирующего действия вирусного антигена специфическими иммунными сыворотками.

РТГА. В реакции использовали рабочее разве­дение антигена, содержащее в 0,25 мл 2 единицы антигена. До постановки реакции исследуемые сы­воротки освобождали от термолабильных (прогре­вание при 56°С в течение 30 мин) и термостабиль­ных (обработка фильтратом холерного вибриона) ингибиторов. Реакцию проводили по стандартной методике. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирующую активность антигена.

Определение иммуногенности холодоадапти­рованных (ХА) вакцинных штаммов vFiraVax VZV и vZelVax HZV проводили на животной модели. Мор­ским свинкам массой 300-400 г вводили подкожно одну прививочную дозу вакцины против ВО и ОГ. Через 2, 3 и 5 мес с момента иммунизации из сердца извлекали кровь для постановки реакции нейтрали­зации и РТГА.

Из иммунных сывороток были удалены тер­молабильные и термостабильные ингибиторы для реакции нейтрализации и РТГА. В качестве ней­трализующего вируса в реакции нейтрализации ис­пользовали вакцину VariVax (США), содержащую 1000 БОЕ50/0,5 мл или 6 lg ГАДЕ50/0,5 мл.

Реакция нейтрализации была поставлена на клетках КМ 27. Реакцию нейтрализации учитывали на 7-е сутки с момента постановки, титр устанав­ливали на основе 100% защиты клеточных культур.

Статистическую обработку проводили с помо­щью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В процессе холодовой адаптации вирусы, как правило, приобретают мутации по температурочувствительности (ts-фенотип) и холодоадаптированности (ca-фенотип). Эти два фенотипа являются ос­новными лабораторными контролями кандидатов в вакцинные штаммы для живой вирусной вакцины, т.е. основными биологическими маркерами аттену­ированных вирусных штаммов [9].

В табл. 1 и 2 представлены результаты титро­вания аттенуированных штаммов и диких родитель­ских штаммов VZV и HZV на диплоидных клетках ФЭМС и MRC-5.

 

Таблица 1. Определение ts- и са-маркеров биологической аттенуации кандидатов в вакцинные штаммы VZV на клетках ФЭМС

Table 1. Identification of ts- and ca-markers of biological attenuation of candidate VZV vaccine strains on GPFF cells

Вирусный штамм

Viral strain

Инфекционный титр VZV и НZV при различных температурных режимах, lg гАдЕ50/0,1 мл

The VZV and HZV infectious titer at different temperatures, lg HAU50/0,1 ml

30°С

36°С

39°С

vFiraVax VZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

vFiraVax VZV, 19th passage, vaccinated liquid, 11 days

9,0

7,75

0

vFiraVax VZV, 19-й пассаж, инфицированные клетки, 11 сут

vFiraVax VZV, 19th passage, infected cells, 11 days

12,8

11,8

0

pFira VZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

pFira VZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 11 days

7,75

7,5

6,5

vZelVax HZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

vZelVax HZV, 19th passage, vaccinated liquid, 11 days

8,5

6,5

0

vZelVax HZV, 19-й пассаж, инфицированные клетки, 11 сут

vZelVax HZV, 19th passage, infected cells, 11 days

12,8

10,3

0

pZel HZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

pZel HZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 11 days

7,5

7,5

6,5

vОКА/Merck (USA)

6,5

5,5

0

Примечание. Здесь и в табл. 2-6: v — вакцинный штамм, p — родительский штамм.

Note. Here and in Tables 2-6: v — a vaccine strain, p — a parental strain.

 

 

Таблица 2. Определение ts- и са-маркеров биологической аттенуации кандидатов в вакцинные штаммы VZV на клетках MRC-5

Table 2. Identification of ts- and ca-markers of biological attenuation of candidate VZV vaccine strains on MRC-5 cells

Вирусный штамм

Viral strain

Инфекционный титр VZV и НZV при различных температурных режимах, lg гАдЕ50/0,1 мл

The VZV and HZV infectious titer at different temperatures, lg HAU50/0,1 ml

30°С

36°С

39°С

vFiraVax VZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

vFiraVax VZV, 19th passage, vaccinated liquid, 11 days

9.5

7,75

0

vFiraVax VZV, 19-й пассаж, инфицированные клетки, 11 сут

vFiraVax VZV, 19th passage, infected cells, 11 days

12,8

10,8

0

pFira VZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

pFira VZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 11 days

8,0

7,25

6,5

vZelVax HZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

vZelVax HZV, 19th passage, vaccinated liquid, 11 days

8,5

7,5

0

vZelVax HZV, 19-й пассаж, инфицированные клетки, 11 сут

vZelVax HZV, 19th passage, infected cells, 11 days

12,3

11,3

0

pZel HZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 11 сут

pZel HZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 11 days

8,0

8,0

6,5

vОКА/Merck (USA)

6,5

6,0

0

Представленные в табл. 1 и 2 результаты де­монстрировали, что кандидаты в вакцинные ви­русные штаммы vFiraVax VZV и vZelVax HZV не репродуцировались при непермиссивной темпера­туре 39°С, т.е. обладали температурочувствительностью — ts-фенотипом, и репродуцировались бо­лее эффективно при субоптимальной температуре, т.е. обладали холодоадаптированностью — са-фенотипом.

Кандидаты в вакцинные штаммы должны так­же различаться по способности репродуцироваться в клеточной культуре ФЭМС. При этом аттенуиро­ванные штаммы VZV должны обладать более высо­кой репродуктивной активностью в этих клетках по сравнению с дикими вирусными изолятами.

В табл. 3 представлены результаты определе­ния титров аттенуированных и родительских ви­русов VZV и HZV, репродуцирующихся в клетках ФЭМС и оцененных по реакции гемадсорбирующей активности на диплоидных клетках ФЭМС.

 

Таблица 3. Сравнительная репродуктивная активность аттенуированных и родительских вирусных штаммов VZV в клетках ФЭМС

Table 3. Comparative reproductive activity of attenuated and parental VZV virus strains in GPFF cells

Вирусный штамм

Viral strain

Инфекционный
титр VZV и НZV, lg ГАДЕ50/0,1 мл

Infectious titer VZV and НZV, lg HAU50/0,1 ml

vFiraVax VZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 14 сут

vFiraVax VZV, 19th passage, vaccinated liquid, 14 days

8,5

pFira VZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 14 сут

pFira VZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 14 days

6,5

vZelVax HZV, 19-й пассаж, ВСЖ, 14 сут

vZelVax HZV, 19th passage, vaccinated liquid, 14 days

8,0

pZel HZV, 2-й пассаж, ВСЖ, 14 сут

pZel HZV, 2nd passage, vaccinated liquid, 14 days

6,5

Результаты, представленные в табл. 3, показы­вали, что инфекционная активность родительских вариантов VZV, установленная на клетках ФЭМС, на 1,5-2,0 lg ГАДЕ50/0,1 мл ниже по сравнению с ат­тенуированными штаммами VZV. Это указывало на другой биологический маркер аттенуации кандидатных вакцинных штаммов для живых культу­ральных вакцин.

Нами разработаны новые маркеры биологиче­ской аттенуации кандидатных вакцинных штаммов VZV.

Антиидиотипические моноклональные антите­ла, направленные к рецепторам ИФН-α/β и ИФН-у на иммунокомпетентных клетках человека, инду­цированных in vitro VZV, использовали для оценки количественных показателей уровня экспрессии ИФН-рецепторов [6][7]. Ранее на модели различных штаммов вируса кори нами показано, что уровень и продолжительность экспрессии ИФН-рецепторов находились в обратной зависимости от степени ат­тенуации вируса кори [10].

Проведена сравнительная оценка показателей экспрессии рецепторов ИФН-α/β и ИФН-у на МКЧ периферической крови, индуцированных кандидатными ХА-штаммами vFiraVax VZV и vZelVax HZV на ранних и поздних пассажных уровнях. В табл. 4 и 5 представлены результаты этого исследования. Полученные данные показали, что оба вирусных ХА-штамма VZV индуцировали более низкий уро­вень экспрессии рецепторов для ИФН-α/β и ИФН-у в сравнении с их родительскими вариантами. Дан­ный биологический маркер аттенуации кандидатных штаммов VZV назвали экспресс-ИФН-фенотипом. Этот фенотип может быть использован и для других аттенуированных вирусных вакцинных штаммов.

 

Таблица 4. Сравнительная экспрессия рецепторов для ИФН-a/p (в %) на МКЧ, индуцированных in vitro аттенуированными и родительскими штаммами VZV на разных пассажных уровнях

Table 4. Comparative expression of IFN-a/p receptors (%) on HMC induced in vitro by attenuated and parental VZV strains at different passage levels

Вирусный штамм

Viral strain

Экспрессия рецепторов для ИФН-α/β на МКЧ в различные временные интервалы (в часах)

Expression of IFN-α/β receptors on HMC at different time intervals (hours)

3

24

48

72

pFira VZV, 3-й пассаж pFira VZV, 3rd passage

14,8 ± 0,9

23,9 ± 1,3

20,0 ± 0,6

6,6 ± 0,7

vFiraVax VZV, 17-й пассаж vFiraVax VZV, 17th passage

3,6 ± 0,5*

8,1 ± 0,4**

4,5 ± 0,4**

1,6 ± 0,3**

pZel HZV, 3-й пассаж pZel HZV, 3rd passage

13,5 ± 0,9

13,4 ± 1,0

17,8 ± 0,8

6,4 ± 0,5

vZelVax HZV 17-й пассаж vZelVax HZV, 17th passage

4,3 ± 0,7**

9,4 ± 1,0*

9,0 ± 0,3**

4,3 ± 0,7*

Ellen# VZV

27,8 ± 3,2

18,8 ± 1,4

15,8 ± 2,3

11,6 ± 1,5

Примечание. Здесь и в табл. 5: уровень экспрессии ИФН-рецепторов определяли путем вычисления процентного соотношения све­тящихся клеток из общего числа 2000 клеток, подсчитанных на 4 образцах МКЧ для каждого временного интервала. # Вирус сконцен­трирован ультрацентрифугированием и очищен в сахарозном градиенте.

*р < 0,05, **p < 0,001 по сравнению с родительским штаммом.

Note. Here and in Table 5: The expression of IFN-receptors was estimated through calculating the percentage of light-producing cells in the total number of 2,000 cells, using 4 HMC samples for each time interval. # The virus was concentrated by ultracentrifugation and purified in sucrose density gradient.

* p < 0.05, **p < 0.001 as compared to the parental strains.

 

 

Таблица 5. Сравнительная экспрессия рецепторов для ИФН-y (в %) на МКЧ, индуцированных in vitro аттенуированными и родительскими штаммами VZV на разных пассажных уровнях

Table 5. Comparative expression of IFN-Yreceptors (%) on HMC induced in vitro by attenuated and parental VZV strains at different passage levels

Вирусный штамм

Viral strain

Экспрессия рецепторов ИФН-y на МКЧ в различные временные интервалы (в часах)

Expression of IFN-y receptors on HMC at different time intervals (hours)

3

24

48

72

pFira VZV, 3-й пассаж

pFira VZV, 3rd passage

5,8 ± 1,0

14,9 ± 1,1

15,1 ± 0,9

12,0 ± 0,4

vFiraVax VZV, 17-й пассаж

vFiraVax VZV, 17th passage

3,6 ± 0,5*

8,1 ± 0,4**

4,5 ± 0,4**

6,0 ± 0,3**

pZel HZV, 3-й пассаж

pZel HZV, 3rd passage

7,9 ± 0,8

14,4 ± 0,9

14,3 ± 1,2

11,13 ± 0,5

vZelVax HZV, 17-й пассаж

vZelVax HZV, 17th passage

4,8 ± 0,9*

4,9 ± 0,9**

7,1 ± 0,9**

5,2 ± 0,02**

Ellen VZV

16,6 ± 1,6

12,5 ± 0,35

10,4 ± 0,6

9,0 ± 0,71

Еще одним биологическим маркером аттену­ации для вакцинных штаммов VZV является ви­рулентность аттенуированных штаммов (att-фено­тип). Нами обнаружено, что при заражении ХАО развивающихся куриных эмбрионов ВСЖ от дикого вируса эмбрионы гибли, а если оставались живыми, то на ХАО появлялась обширная геморрагия крове­носных сосудов. При заражении ХАО ВСЖ от атте­нуированных штаммов VZV на ХАО обнаруживали белые оспины.

Важным свойством аттенуированных вакцин­ных вирусных штаммов является их иммуногенность. В табл. 6 приведены результаты титрования иммунных сывороток в реакции нейтрализации и РТГА.

 

Таблица 6. Иммуногенность аттенуированных вакцинных штаммов vFiraVax VZV и vZelVax HZV, установленная иммунизацией морских свинок с оценкой в реакции нейтрализации на культуре клеток и в РТГА в различные временные интервалы

Table 6. Immunogenicity of attenuated vFiraVax VZV and vZelVax HZV vaccine strains through immunization of guinea pigs and a neutralization test on cell culture and in HAI assay at different time intervals

Иммунные сыворотки к вакцинным штаммам

VZV Immune sera for VZV vaccine strains

Реакция нейтрализации (со 100% защитой)

Neutralization test (at 100% protection)

РТГА (гемагглютинин, штамм Ellen VZV)

HAI assay (hemagglutinin, Ellen VZV strain)

срок с момента иммунизации, мес

time since immunization, months

2

3

5

2

3

5

vFiraVax VZV, 20-й пассаж

vFiraVax VZV, 20th passage

1 :1600

1:1600

1 :1600

1 :25600

1 :12800

1 : 6400

vZelVax HZV, 20-й пассаж

vZelVax HZV, 20th passage

1 :1600

1 :1600

1 :1600

1 :25600

1 :12800

1 : 6400

Нейтрализующий VZV-штамм vOka, 1000 доз

Neutralizing VZV strain vOka, 1000 doses

6,0 lg ГАДЕ50/0,1 мл

6.0 lg HAU50/0,1 ml

Результаты, представленные в табл. 6, пока­зали, что нейтрализующая активность иммунных вирусспецифических сывороток по отношению к кандидатным вакцинным штаммам vFiraVax VZV и vZelVax HZV как в реакции нейтрализации, так и в РТГА была высокой. При этом надо отметить, что титры иммунных сывороток в реакции нейтрали­зации оставались высокими на протяжении всех 5 мес исследования, в то время как титры иммунных сывороток в РТГА к этому сроку снизились почти в 4 раза. Известно, что вирусные гемагглютинины менее стабильны по сравнению с вирусными нейтрализинами.

Обсуждение

В данном исследовании мы изучали биологи­ческие маркеры аттенуации созданных нами ХА кандидатных штаммов VZV и HZV для создания живых культуральных вакцин против ВО у детей и ОГ у взрослых после 50 лет.

Экспериментально было установлено, что оба ХА-штамма обладали основными биологическими маркерами аттенуации: ts- и ca-фенотипом (табл. 1, 2). Для вирусных штаммов VZV характерен еще один дополнительный фенотип, названный нами cell-фенотипом, т.е. изменение тканевого тропизма. Дикие варианты клинических изолятов VZV, как правило, обладают более низкой репродуктивной активностью в первичных клетках эмбрионов мор­ской свинки в сравнении с аттенуированными ви­русными штаммами. Экспериментально установле­но, что ХА-штаммы vFiraVax VZV и vZelVax HZV обладали cell-фенотипом (табл. 3).

В настоящее время не существует модельного объекта для оценки вирулентности VZV — att-фе­нотипа. Нами обнаружено, что подходящей моде­лью является ХАО развивающихся куриных эм­брионов. Установлено, что родительские варианты вирусов VZV вызывают гибель эмбрионов или об­ширную геморрагию ХАО, а ХА вирусные штаммы VZV вызывали образование белых оспин. Кандидатные ХА-штаммы vFiraVax VZV и vZelVax HZV оказались авирулентными и обладали att-феноти­пом. Этот же метод можно использовать для оценки генетической стабильности вакцинных вирусных штаммов VZV.

Нами предложен новый маркер биологической аттенуации кандидатных вакцинных штаммов. Так, ранее нами был разработан новый методический подход к оценке функционального состояния систе­мы ИФН [6][7]. С этой целью использовали высоко­чувствительные и специфичные флюоресцирующие зонды на основе моноклональных антиидиотипических антител, имитирующих биологические эффек­ты ИФН-α/β и ИФН-у человека. Обследование об­разцов крови доноров с различными группами кро­ви не выявило на МКЧ экспрессии рецепторов для ИФН-а и ИФН-у, что указывало на сбалансирован­ное функционирование системы ИФН в организме [7]. При индукции in vitro МКЧ периферической крови доноров различными штаммами вирусов ко­ри установлено, что уровень и продолжительность экспрессии рецепторов для различных типов ИФН находились в обратной зависимости от степени ат­тенуации вируса кори [10].

В наших экспериментах ХА-штаммы VZV и HZV экспрессировали на мембранах МКЧ более низкий уровень рецепторов для ИФН-α/β и ИФН-у (табл. 4 и 5), и эти показатели были стабильными, что позволило нам считать этот экспресс-ИФН-фенотип характерным для всех аттенуированных вак­цинных штаммов.

Самым важным свойством живых ХА-вакцин является их более высокая эффективность по срав­нению с инактивированными вакцинами, поскольку они обладают способностью вызывать более эффек­тивные врожденный и адаптивный гуморальный и клеточный иммунные ответы [11][12].

Иммуногенность аттенуированных вакцин­ных штаммов vFiraVax и vZelVax изучали путем подкожной иммунизации морских свинок. Оце­нивали гуморальный иммунный ответ в реакциях нейтрализации против 1000 доз вируса, содержа­щихся в вакцине OkaVax/Merck (США), и в РТГА против 2-гемагглютинирующих единиц гемагглютинина, полученного из лабораторного вирусно­го штамма Ellen VZV. ХА-вакцинные штаммы vFiraVax VZV и vZelVax HZV обладали высокой иммуногенностью на протяжении 5 мес наблюде­ния (табл. 6).

Таким образом, нами созданы и охарактери­зованы два ХА-вакцинных штамма: vFiraVax VZV и vZelVax HZV — кандидаты для создания живых культуральных вакцин для профилактики ВО у де­тей и ОГ у взрослых.

Список литературы

1. Greenberg H.B., Arvin A.M. Live attenuated vaccines: influenza, rotavirus and varicella zoster virus. In: Dormitzer P., Mandl C., Rappuoli R., eds. Replicating Vaccines. Birkhäuser Advances in Infectious Diseases. Basel: Springer Basel; 2011. DOI: http://doi.org/10.1007/978-3-0346-0277-8_2

2. Gould D. Varicella zoster virus: chickenpox and shingles. Nurs. Stand. 2014; 28(33): 52-8. DOI: http://doi.org/10.7748/ns2014.04.28.33.52.e8249

3. Kennedy P.G.E., Gershon A.A. Clinical features of varicella – zoster virus infection. Viruses. 2018; 10(11): 609-20. DOI: http://doi.org/10.3390/v10110609

4. Sadaoka T., Mori Y. Vaccine development for varicella – zoster virus. Adv. Exp. Med. Biol. 2018; 1045: 123-42. DOI: http://doi.org/10.1007/978-981-10-7230-7_7

5. Seward J.F., Marin M., Vázquez M. Varicella vaccine effectiveness in the US vaccination program: a review. J. Infect. Dis. 2008; 197(Suppl. 2): S82-9. DOI: http://doi.org/10.1086/522145

6. Баркова Е.П., Нагиева Ф.Г., Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Никулина В.Г., Бабаянц А.А. и др. Экспрессия рецепторов для человеческих α- и γ-интерферонов на поверхности мононуклеарных клеток периферической крови при вирусных инфекциях. Вопросы вирусологии. 1999; 44(1): 16-8.

7. Баркова Е.П., Вдовина Е.Т., Нагиева Ф.Г., Ющук Н.В., Знойко О.О., Никулина В.Г. и др. Функциональная активность интерфероновых рецепторов мононуклеаров периферической крови пациентов с вирусными гепатитами. Биопрепараты. 2001; (4): 18-21.

8. Norrby E. Hemagglutination by measles virus. 4. A simple procedure for production of high potency antigen for hemagglutination-inhibition (HI) tests. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962; 3(3): 814-8. DOI: http://doi.org/10.3181/00379727-111-27930

9. Исакова И.Н., Киселева И.В., Ларионова Н.В., Олейник Е.С., Руденко Л.Г. Лабораторные маркеры аттенуации штаммов живой гриппозной вакцины. Вопросы вирусологии. 2007; 52(4): 22-6.

10. Баркова Е.П., Нагиева Ф.Г., Лавров В.Ф., Никулина В.Г., Ляшенко В.А. Экспрессия интерфероновых рецепторов и мембраносвязанных интерферонов на поверхности иммунокомпетентных клеток, инфицированных различными штаммами вируса кори. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. 2006; (8): 123-5.

11. Badgett M.R., Auer A., Carmichael L.E., Parrish C.R., Bull J.J. Evolutionary dynamics of viral attenuation. J. Virol. 2002; 76(20): 10524-9. DOI: http://doi.org/jvi.76.20.10524-10529.2002

12. Martínez-Sobrido L., Peersen O., Nogales A. Temperature sensitive mutations in influenza A viral ribonucleoprotein complex responsible for the attenuation of the live attenuated influenza vaccine. Viruses. 2018; 10(10): 560. DOI: http://doi.org/10.3390/v10100560


Об авторах

Фирая Галиевна Нагиева
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт им. И.И. Мечникова»
Россия
д.м.н., доцент, зав. лаб. гибридных клеточных культур отдела вирусологии


Елена Петровна Баркова
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт им. И.И. Мечникова»
Россия
к.б.н., в.н.с. лаб. гибридных клеточных культур отдела вирусологии


Александра Дмитриевна Строева
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт им. И.И. Мечникова»
Россия
м.н.с. лаб. гибридных клеточных культур отдела вирусологии


Александр Викторович Сидоров
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт им. И.И. Мечникова»
Россия
к.б.н., зав. лаб. генетики ДНК-содержащих вирусов отдела вирусологии


Виталий Васильевич Зверев
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт им. И.И. Мечникова»
Россия
д.б.н., проф., академик РАН, научный руководитель института


Дополнительные файлы

1. Графическое резюме
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Посмотреть (82KB)    
Метаданные
Просмотров: 148


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)