Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Выявление штаммов Vibrio cholerae «гаитянской» группы с помощью полимеразной цепной реакции на основе INDEL-типирования

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9

Полный текст:

Аннотация

Цель работы состояла в целенаправленном поиске генетического INDEL-маркера «гаитянской» группы штаммов холерных вибрионов, позволяющего проводить их идентификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Материалы и методы. Для поиска INDEL-маркеров использованы полученные из системы GenBank данные полногеномного секвенирования штаммов Vibrio cholerae El Tor, изолированных на разных континентах в различные годы. Для анализа применяли авторское программное обеспечение, написанное на языке программирования Java. Для картографирования использована система NextGIS.

Результаты и обсуждение. Установлено, что делеция 8 нуклеотидов в гене VCA1095, расположенном на малой хромосоме и кодирующем chemotaxis protein СheA, является характерным генетическим признаком «гаитянской» группы штаммов. Разработаны праймеры для выявления данной делеции в ПЦР.

Заключение. Разработана методика выявления штаммов холерных вибрионов «гаитянской» группы на основе анализа INDEL-маркеров и показано распределение таких штаммов в мире до и после 2010 г.

Для цитирования:


Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Писанов Р.В. Выявление штаммов Vibrio cholerae «гаитянской» группы с помощью полимеразной цепной реакции на основе INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020;97(3):265-270. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9

For citation:


Vodop’yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Pisanov R.V. Identification of Vibrio cholerae Strains of the «Haitian» Group by PCR Based on INDEL-Typing. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2020;97(3):265-270. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9

Расследование вспышек опасных инфекцион­ных заболеваний требует разработки эффективных методик внутривидовой дифференцировки воз­будителей и поиска генетических маркеров групп штаммов, имеющих большое эпидемиологическое значение. Так, полногеномное секвенирование штаммов Vibrio cholerae, вызвавших масштабную вспышку холеры на о. Гаити в 2010 г., позволило выявить единичные нуклеотидные замены (SNP) в гене ctxB, что привело к появлению штаммов с уникальным генотипом B7, характеризующихся повышенной вирулентностью [1, 2]. Впоследствии для выявления штаммов, несущих холерный ток­син «гаитянского» типа (B7), была разработана аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (ПЦР) [3]. Однако использование для дифференци­ации штаммов лишь нескольких SNP в гене ctxB, на наш взгляд, является ненадежным методом ввиду возможности появления новых нуклеотидных за­мен в гене холерного токсина.

Одним из простых и удобных методов при уче­те результатов генотипирования с помощью ПЦР является изучение полиморфизма INDEL-маркеров. Так, разработаны схемы INDEL-генотипирования возбудителя туляремии [4] и холеры [5, 6]. Недав­но предложена схема генотипирования штаммов Y. pestis на основе INDEL-маркеров, позволяющая быстро определять биовар с помощью ПЦР [7]. В свя­зи с этим цель настоящего исследования состояла в целенаправленном поиске INDEL-маркера «гаитян­ской» группы штаммов, позволяющего проводить надежную идентификацию этих штаммов в биоло­гическом материале методом ПЦР с электрофорети­ческим учетом результатов.

Материалы и методы

Для поиска INDEL-маркеров использованы геномы «гаитянских» штаммов V. cholerae El Tor HC-38A1, HC-06A1, HC-23A1, HC-28A1, HC-43A1, HC-61A1, HC-48B2 и геномы штаммов, изолиро­ванных на разных континентах ранее (V. cholerae El Tor N16961, O395, A186, A60, A217, CRC1106, E506, E1162, M2140, E9120, 16241D, 41D, 169D, 1270D). Наименования генов и позицию INDEL-марке­ра указывали по референсному геному штамма V. cholerae N16961 (GenBank Accession Number NC002505.1 и NC002506.1). Сборку геномов, пред­ставленных в виде ридов, проводили с исполь­зованием программы «Spades» [8]. Для анализа применяли авторское программное обеспечение GeneExpert, PrimerM и VirtualPCR, написанное на языке программирования Java, для картографирова­ния — систему NextGIS. Встречаемость маркера в популяции V. cholerae оценивали по локальной базе данных, содержащей 900 геномов.

ДНК выделяли с использованием коммерче­ских наборов реагентов «Проба НК» («ДНК-технология») и «ДНК-Сорб-В» («АмплиСенс»).

ПЦР проводили в объеме 15 мкл в полистироловых микроцентрифужных пробирках на програм­мируемом многоканальном термоциклере «Терцик» («ДНК-технология»). Инкубационная смесь (15 мкл) для ПЦР содержала 20 мМ трис-НО, рН 8,6; 7 мМ MgCI2, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,5 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, по 250 мкМ каж­дого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,1-1,0 мкМ соответствующего праймера, 2 ед. Taq-полимеразы и 1-10 нг хромосомальной ДНК исследуемого штам­ма. Режим амплификации после внесения минераль­ного масла: денатурация — 94°С, 35 с, отжиг — 60°С, 25 с, синтез — 72°С, 35 с (всего 40 циклов).

Валидацию размера ампликонов INDEL-мар­кера «1095» проводили с помощью автоматической электрофорезной станции «Experion™» («Bio- Rad») с применением набора «Experion DNA 1K reagent and Supplies for 10 chips» согласно инструк­ции производителя.

Детекцию ампликонов и разделение аллелей по заданному локусу осуществляли в неденатуриру­ющем 11% полиакриламидном геле (ПААГ) (2 мкл постреакционной смеси на дорожку геля, длина геля 15 см, 15-20 В/см). В качестве аллельного ладдера использовали смесь всех выявленных аллелей ана­лизируемого локуса. Генотип штамма определяли путем сопоставления длины пробега полученных ампликонов аллелей с ладдерной ДНК после окра­шивания геля бромистым этидием (1 мкг/мл) и ви­зуализации в проходящем ультрафиолете (220 нм) трансиллюминатора «ViberLaurmat» («LKB»).

Результаты и обсуждение

Первый этап работы выполняли в программе «GeneExpert», сравнивая попарно все INDEL-мар­керы в открытых рамках считывания в геномах штаммов, обусловивших эпидемические осложне­ния по холере на о. Гаити и имеющих «гаитянский» вариант (B7) гена ctxB [2]. Это позволило оста­вить для дальнейшего анализа только стабильные INDEL-полиморфизмы, которые были одинаковы у всех изученных «гаитянских» штаммов.

Второй этап работы заключался в сравнитель­ном анализе INDEL-маркеров, отобранных на пер­вом этапе, и аналогичных маркеров токсигенных штаммов V cholerae, выделенных до 2010 г. Это позволило установить, что делеция 8 нуклеотидов в гене VCA1095 (в позиции 422-429), расположен­ном на малой хромосоме и кодирующем chemotaxis protein CheA, присутствует у всех «гаитянских» и отсутствует у других токсигенных (ctxAB+) штам­мов.

На третьем этапе работы с помощью авторской программы «PrimerM» нами были сконструированы праймеры (прямой 5'-ccatcagtctgcctctgacac-3', об­ратный 5'-ttcgacaatcgtcagtagcg-3'), фланкирующие INDEL-маркер «1095», что дало возможность выяв­лять его в ПЦР in silico. Для этой цели нами были получены данные полногеномного секвенирования из базы данных GenBank. Обращает на себя вни­мание, что геномы некоторых штаммов, выделен­ных в последние годы, представлены только в ви­де первичных данных секвенирования (ридов), что побудило нас самостоятельно провести их сборку в контиги. В локальной базе полных геномов, исполь­зованных на этом этапе работы, была информация о 900 геномах штаммов V cholerae, 520 из которых содержали профаг CTX (гены ctxAB).

Анализ локальной базы данных с помощью программы «VirtualPCR» позволил выявить делецию 8 п.о. (INDEL-маркер «1095») в гене VCA1095 («гаитянский вариант») у 184 штаммов, причем ее наличие четко коррелировало с генотипом B7 гена холерного токсина ctxB. При этом нетоксигенные (ctxAB-) штаммы V. cholerae и штаммы nonО1/ попО139 серогруппы имели «дикий» аллель гена VCA1095 (не содержащий делецию 8 п.о.). На наш взгляд, использование сконструированных нами праймеров является более простым и надежным методом выявления штаммов «гаитянской» группы по сравнению с известными приемами секвенирования или аллель-специфичной ПЦР [2, 3].

Большой интерес вызвало происхождение штаммов с «гаитянским вариантом» INDEL-марке­ра «1095». Изучение геномов штаммов V. cholerae, представленных в базе GenBank, с помощью про­граммы «VirtualPCR» позволило выявить его при­сутствие у 9 штаммов, изолированных до возникно­вения вспышки на о. Гаити в 2010 г. (табл. 1). При­мечательно, что у всех штаммов (кроме 2011EL-1137 и MBN17) обнаружен ген ctxB именно «гаитянского генотипа» (B7). Важно отметить, что ранее уже опи­сано обнаружение штаммов, выделенных до 2010 г. и имеющих аллель B7 гена ctxB [3], что косвенно под­тверждает наши данные. Полученные нами результа­ты позволяют рассматривать штаммы 2011EL-1137 и MBN17 как своего рода «прегаитянские».

 

Таблица 1. Штаммы V. cholerae, выделенные до 2010 г и содержащие «гаитянский вариант» INDEL-маркера «1095»

Table 1. Vibrio cholerae strains, isolated before 2010 year, which contain «Haitian» variant of INDEL-marker «1095»

Штамм

Strain

Год

Year

Место выделения штамма

Place of strain isolation

Тип ctxB [2]

Type of ctxB [2]

2009V-1085

2009

США, завоз из Шри-Ланка

USA, import from Sri Lanka

B7

2009V-1096

2009

США, завоз из Индии

USA, import from India

B7

2009V-1131

2009

США, завоз из Индии

USA, import from India

B7

2011EL-1137

2009

Южная Африка

South Africa

B1

3554-08

2008

США, завоз из Непала

USA, import from Nepal

B7

IDHO1_726

2009

Индия

India

B7

4519

2005

Индия

India

B7

MBN17

2004

Индия

India

B1

4538

2007

Индия

India

B7

Не менее интересным является анализ штаммов V. cholerae, выделенных после 2010 г. на о. Гаити. Ис­пользование программы «VirtualPCR» позволило вы­явить 74 штамма V. cholerae, несущих «гаитянский вариант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095» (примеры приведены в табл. 2). Обращает на себя внимание, что именно эти штаммы были зане­сены в города Мариуполь (2011 г.) и Москва (2012 г.). Именно в этот период в Ростове-на-Дону были вы­делены токсигенные штаммы, не содержащие INDEL-маркер «1095» в локусе VCA1095 и имею­щие ctxB генотипа B3, что подтверждает циркуля­цию в настоящее время штаммов «гаитянского» и других генотипов. Также необходимо отметить, что штаммы, ежегодно выделяемые от людей в округе Дели (Индия) и полученные при вспышке холеры в Республике Йемен, тоже несут «гаитянский ва­риант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095» и ctxB, несущих аллель B7 [9].

 

Таблица 2. Штаммы V. cholerae, выделенные после 2010 г., содержащие «гаитянский» аллель INDEL-марке­ра «1095»

Table 2. V. choleraе strains, isolated after 2010 year, which contain «Haitian» variant of INDEL-marker «1095»

Год выделения

Isolation year

Место выделения, по данным GenBank

Place of strain isolation based on GenBank data

2011

Доминиканская Республика

Dominican Republic

2011

Бангладеш / Bangladesh

2011

Украина, Донецкая область, Мариуполь

Ukraine, Donetsk region, Mariupol

2011

Камерун / Cameroon

2012

Гаити / Haiti

2012

Россия, Москва / Russia, Moscow

2013

Индия, штат Керала

India, Kerala

2014

Гаити, Юго-Восточный департамент

Haiti, South-Eastern Department

2014

Уганда / Uganda

2015

Танзания, Сингида

Tanzania, Singida

2015

Танзания, Maрa / Tanzania, Mara

2015

Танзания, Дар-эс-Салам

Tanzania, Dar es Salaam

2015

Танзания, Морогоро

Tanzania, Morogoro

2015

Индия, штат Западная Бенгалия, Калькутта

India, West Bengal state, Calcutta

2016

Уганда, Истерн-Уганда, Мбале

Uganda, Eastern Uganda, Mbale

2016

Йемен / Yemen

2016

Индия, Дели / India, New Delhi

2017

Йемен / Yemen

2017

Индия, Дели / India, New Delhi

Размер описываемой делеции в гене VCA1095 составляет 8 нуклеотидов, что не кратно стандарт­ному кодирующему триплету, ее появление в гено­ме «гаитянских» штаммов приводит к сдвигу рамки считывания и формированию стоп-кодона (рис. 1). Таким образом, согласно данным биоинформационного анализа, делеция 8 п.о. приводит к синтезу трункированного протеина размером 626 аминокис­лот против 720 аминокислот у штаммов «дикого» варианта. Судя по широкому распространению дан­ной делеции, в популяции она, возможно, способ­ствует выживанию вибрионов.

 

Рис. 1. Фрагмент выравнивания аминокислотных последовательностей белка, кодируемого геном VCA1095, у штамма V. cholerae HC1037, содержащего «гаитянский вариант» INDEL-маркера «1095» (вверху), и штамма V. cholerae N16961, не имеющего делеции 8 п.о. (внизу).

Звездочками указан отсутствующий фрагмент гена.

Fig. 1. Fragment of alignment of amino acid sequences of the protein encoded by the VCA1095 gene in the V. cholerae HC1037 strain containing the «Haitian variant» of the INDEL-marker «1095» (top) and the V. cholerae N16961 strain, which does not have a deletion of 8 nucleotides (bottom).

Asterisks indicate the missing gene fragment.

 

Следующим этапом работы было проведение ПЦР in vitro со сконструированными праймерами, фланкирующими делецию 8 п.о. в гене VCA1095. Проведение электрофореза на ДНК-чипах системы «Experion™» позволило подтвердить соответствие размера полученных ампликонов данным биоинформационного анализа: наличие INDEL-марке­ра «1095» — 87 п.о. и отсутствие INDEL-маркера «1095» — 95 п.о. (нижний и верхний фрагменты на электрофореграмме соответственно).

Для дальнейшей работы нами был составлен аллельный ладдер («аллельная лестница»), со­держащий амплифицированные фрагменты обо­их аллелей гена VCA1095, что дало возможность проводить учет результатов ПЦР с помощью элек­трофореза в 11% ПААГ (рис. 2). На наш взгляд, это позволяет рекомендовать разработанную пару праймеров для быстрой идентификации штаммов «гаитянского» типа методом ПЦР.

 

Рис. 2. Результат электрофореза в 11% ПААГ продуктов амплификации образцов ДНК V. cholerae со специфическими праймерами, фланкирующими INDEL-маркер «1095».

3 и 7 — маркеры молекулярного веса, содержащие смесь ампликонов размером 95 и 87 п.о.; 2 и 6 — результат амплифи­кации гена VCA1095, не содержащего INDEL-маркер «1095» (95 п.о.); 1, 4 и 5 — результат амплификации гена VCA1095 «гаитян­ского» типа (87 п.о.) с наличием INDEL-маркера «1095».

Fig. 2. Results of electrophoresis in 11% PAAG of fragments of V. cholerae DNA amplified with specific primers flanking the INDEL-marker «1095».

3 and 7 — markers of molecular weight, containing a mixture of amplicons of size alleles 95 and 87 nucleotides; 2 and 6 — the result of amplification of gene VCA1095 not containing the INDEL-marker «1095» (95 nucleotides); 1, 4 and 5 — the result of amplification of gene VCA1095 «Haitian» type (87 nucleotides) with the presence of the INDEL-marker «1095».

 

Нам представлялось интересным изучить штаммы V. cholerae, для которых ранее были по­лучены противоречивые результаты при проведе­нии исследования разными группами авторов. Так, ранее анализ данных полногеномного секвенирования позволил выявить, что изоляты V. cholerae O1 № 19187 и 19188, выделенные в 2010 г. в Мо­скве, согласно данным SNP-типирования относят­ся к штаммам «гаитянской группы» [10]. Однако при анализе с использованием другого набора SNP указанные штаммы попали в группу «непальских штаммов», дистанцированную от штаммов, вы­звавших вспышку на о. Гаити [11]. Проведение как виртуальной ПЦР in silico, так и последующей ПЦР in vitro позволило установить у данных штаммов наличие «гаитянского варианта» гена VCA1095 с присутствием INDEL-маркера «1095». В пользу правомочности такого результата свидетельствует наличие у данных штаммов аллеля B7 гена ctxB, что также является признаком «гаитянских» штаммов.

Заключение

В ходе исследования апробирована методика целенаправленного поиска INDEL-маркеров для выявления заранее известной группы штаммов. Об­наружен «гаитянский» вариант гена VCA1095, со­держащий INDEL-маркер «1095», являющийся от­личительным признаком штаммов, обусловивших эпидемические осложнения по холере на о. Гаи­ти в 2010 г. и в Республике Йемен в 2016-2017 гг. Сконструированы праймеры и подобраны условия для выявления делеции 8 п.о. методом ПЦР, что позволило подтвердить принадлежность штам­мов V. cholerae O1 № 19187 и 19188, выделенных в 2010 г. в Москве, к «гаитянской» группе. Пока­зано мировое распространение штаммов, несущих «гаитянский вариант» гена VCA1095 с наличием INDEL-маркера «1095», до и после 2010 г.

Список литературы

1. Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., et al. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; (10): 111. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00111

2. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1): 46-54. DOI: http://doi.org/10.1016/j.tim.2009.10.003

3. Naha A., Pazhani G.P., Ganguly M., Ghosh S., Ramamurthy T., Nandy R.K., et al. Development and evaluation of a PCR assay for tracking the emergence and dissemination of Haitian variant ctxB in Vibrio cholerae O1 strains isolated from Kolkata, India. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(5): 1733-6. DOI: http://doi.org/10.1128/JCM.00387-12

4. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., Granberg M., Forsman M., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13(11): 1725-32. DOI: http://doi.org/10.3201/eid1311.070603

5. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 41-4.

6. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio choleraе. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(4): 195-200. DOI: http://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200

7. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Motin V.L., Nosov N.Y., Krasnov J.M., Kukleva L.M., et al. Phylogeny and Classification of Yersinia pestis through the lens of strains from the plague foci of Commonwealth of Independent States. Front. Microbiol. 2018; 9: 1106. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01106

8. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., et al. SPAdes: A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5): 455-77. DOI: http://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021

9. Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., Almesbahi A.A., Naji M., Nasher S.S., et al. Genomic insights into the 2016–2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019; 565(7738): 230-3. DOI: http://doi.org/10.1038/s41586-018-0818-3

10. Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д. и др. Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae – разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016; 21(3): 146-52. DOI: http://doi.org/10.18821/1560-9529-2016-21-3-146-152

11. Kuleshov K.V., Vodop'ianov S.O., Dedkov V.G., Markelov M.L., Deviatkin A.A., Kruglikov V.D., et al. Travel-associated Vibrio cholerae O1 El Tor, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2016; 22(11): 2006-8. DOI: http://doi.org/10.3201/eid2211.151727


Об авторах

Алексей Сергеевич Водопьянов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
к.м.н., с.н.с. группы вирусологии


Сергей Олегович Водопьянов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
д.м.н., зав. лаб. биохимии микробов


Игорь Павлович Олейников
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
н.с. лаб. биохимии микробов


Руслан Вячеславович Писанов
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Россия
к.б.н., зав. лаб. диагностики особо опасных инфекций


Для цитирования:


Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Писанов Р.В. Выявление штаммов Vibrio cholerae «гаитянской» группы с помощью полимеразной цепной реакции на основе INDEL-типирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020;97(3):265-270. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9

For citation:


Vodop’yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Pisanov R.V. Identification of Vibrio cholerae Strains of the «Haitian» Group by PCR Based on INDEL-Typing. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2020;97(3):265-270. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-3-9

Просмотров: 29


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)