Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Состав микробиоты репродуктивного тракта женщин при бесплодии

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-1-26-31

Полный текст:

Аннотация

Введение. В настоящее время вопрос об участии комменсальной, в том числе условно-патогенной, микрофлоры в развитии бесплодия остается дискутабельным. Для решения этого вопроса активно внедряются молекулярно-генетические методы исследования, которые превосходят рутинные методики культивирования по ряду позиций.

Цель исследования — оценить таксономическое разнообразие микроорганизмов в вагинальном биотопе при бесплодии.

Материал и методы. Для исследования использовали образцы вагинального содержимого, полученного из заднего свода влагалища 15 женщин, состоящих в бесплодном браке. Метагеномное исследование 16S рибосомной РНК образцов осуществлено на платформе Illumina MiSeq с использованием набора MiSeq Reagent Kits v3 (600-Cycle Kit) согласно рекомендациям производителя. Библиотеки для секвенирования участков V3-V4 гена 16S рибосомной РНК были приготовлены согласно 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina. При биоинформационной оценке применяли программное обеспечение для метагеномного анализа — Kraken Metagenomics version 2.0.0 (классификатор ридов — коротких нуклеотидных последовательностей), используя стандартную базу данных.

Результаты. Показано, что встречаемость представителей семейства Lactobacillaceae в вагинальном биотопе варьирует от 12 до 84%. Ведущее положение среди представителей семейства занимал род Lactobacillus с доминированием L. jensenii, L. delbrueckii и L. amylolyticus. Во всех пробах обнаружены в большом количестве Moraxella spp., причем M. osloensis лидировали среди представителей всего сообщества. В половине случаев выявлено совместное присутствие M. osloensis и G. vaginalis.

Заключение. Установлено, что при бесплодии в вагинальной микробиоте существенно снижается количество представителей рода Lactobacillus, а также наблюдается смена лидирующего вида на L. jensenii, функциональная активность которых не обеспечивает в полной мере колонизационную резистентность вагинального биотопа, допуская избыточное размножение условно-патогенных микроорганизмов, в частности M. osloensis.

Женский репродуктивный тракт представляет собой уникальную экосистему [1]. Предполагается, что компоненты микробиоты влагалища могут присутствовать в эндометриальной ткани, вызывая стимуляцию локальных иммунных факторов, в том числе при участии лактобактерий вагинального биотопа. Есть наблюдения, констатирующие возникновение инфекционно-воспалительных заболеваний в репродуктивных органах, обусловленных влагалищной микрофлорой [2]. В ходе недавних исследований, основанных на секвенировании генов 16S рРНК, установлены 5 типов вагинальной микробиоты, в 3-4 из которых лактобактерии составляют более 90% микробного сообщества [3]. Считается, что в случае их доминирования, обеспечивающего в первую очередь низкий уровень рН, а также достаточно высокое содержание метаболитов с антибактериальной активностью (бактериоцины, пероксид и др.), ингибируется рост потенциально опасных микроорганизмов [4-6]. С другой стороны, немало фактов указывает на то, что нарушение состава микробиоты нижних отделов генитального тракта, проявляющееся прежде всего клиникой бактериального вагиноза (БВ), предрасполагает к развитию инфекций мочевыделительной системы, заболеваний, передающихся половым путем, и преждевременным родам [2].

Вопрос об участии микроорганизмов, особенно комменсальных и мутуалистических, в развитии бесплодия к настоящему времени не решен. Если участие таких возбудителей инфекций, передающихся половым путем, как Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae, в патогенезе этого недуга достаточно подробно описано [7], то многие другие микроорганизмы остаются пока в области научных интересов. В недавних исследованиях показана связь условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) из нижних отделов генитального тракта женщин с неблагоприятными исходами беременности после как естественного, так и искусственного оплодотворения [8]. Более того, отмечается, что УПМ при колонизации генитального тракта, как правило, не вызывают типичных симптомов воспалительного процесса, особенно при локализации в его верхних отделах [9]. Отсутствует и однозначное отношение к БВ как причинному фактору бесплодия [10]. БВ относится к синдромам с полимикробной этиологией, когда создается локальное провоспалительное микроокружение со снижением численности протективных лактобактерий и избыточным ростом анаэробных УПМ [11, 12]. Подобные нарушения в вагинальном биотопе обеспечивают условия, облегчающие восходящую диссеминацию микроорганизмов, что в конечном итоге может привести к трубному бесплодию [13]. Более того, развитие беременности на фоне БВ сопровождается клиническими нарушениями, вплоть до ее прерывания [14].

Цель исследования — оценить таксономическое разнообразие микроорганизмов в вагинальном биотопе при бесплодии.

Материал и методы

Для исследования использовали образцы вагинального содержимого, полученного из заднего свода с помощью мерной ложки Фолькмана от 15 женщин, состоящих в бесплодном браке. Метагеномное исследование 16S рибосомной РНК образцов осуществлено на платформе Illumina MiSeq с использованием набора MiSeq Reagent Kits v3 (600-Cycle Kit) согласно рекомендациям производителя. Библиотеки для секвенирования участков V3-V4 гена 16S рибосомной РНК были приготовлены согласно 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina. При биоинформационной оценке применяли программное обеспечение для метагеномного анализа — Kraken Metagenomics version 2.0.0 (классификатор ридов — коротких нуклеотидных последовательностей), используя стандартную базу данных [15].

Для анализа полученных данных использовали описательную статистику и программу Statistica 7.0. Данные представлены в виде M ± δ.

Результаты исследования

В вагинальном биотопе женщин с бесплодием регистрировали преимущественно бактериальные таксоны, доля которых в общей массе составляла 4999% (83,9 ± 16,02). Генетические маркеры бактерий семейства Lactobacillaceae обнаруживали в 12-84% (41,9 ± 17,99) образцов, причем в половине случаев их содержание не превышало 30% общей бактериальной массы. Ведущее положение среди представителей семейства занимал род Lactobacillus с доминированием L. jensenii, L. delbrueckii и L. amylolyticus. В единичных случаях количество микроорганизмов родов Lactobacillus и Enterococcus было сопоставимым. L. crispatus и L. gasseri обнаруживались в ряде проб, но их доля в генетическом материале была минимальной. Против ожидания, L. iners не обнаружены ни у одной пациентки.

Ведущих участников в этиологии БВ — Gardnerella vaginalis — регистрировали практически во всех пробах, но их доля, как правило, не превышала 1%. Другой возбудитель БВ — Atopobium vagirne — не обнаружен ни в одной пробе, однако в 12 из них присутствовал A. parvulum, также в незначительных количествах.

Примечательно, что в микробиоте влагалища инфертильных женщин удельное содержание анаэробных бактерий — типичных ассоциантов БВ: Actinomyces spp., Peptoniphilus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp. и Mobiluncus curtisii — оказалось минимальным.

Неожиданной находкой для вагинального биотопа стало обнаружение в большом количестве генетического материала Moraxella spp. Во всех пробах M. osloensis занимала лидирующие позиции среди представителей всего сообщества. Так, в половине случаев выявлено совместное присутствие M. osloensis и G. vaginalis, при этом первый симбионт преобладал, а численность гарднерелл составляла порядка 10% бактериальной массы. В трети таких случаев присутствовал Enterococcus faecalis (8-15%). Кроме этого,M. osloensis чаще обнаруживали в пробах, когда среди лактобактерий лидировали представители L. jensenii. В 1 случае 20% генетического материала представлял геном Bifidobacterium longum в сочетании с M. osloensis (19%).

Доля микроорганизмов семейства Staphylococcaceae в микробиоте влагалища только в 1 случае составила 0,5%, в остальных обнаруживали следовые количества, при этом преобладали геномоварианты из рода Staphylococcus. Во всех пробах обнаружены генетические маркеры S. aureus, однако в 3 случаях их количество занимало 2-ю рейтинговую позицию, уступив 1-е место S. haemolyticus. Практически всегда эти бактерии обнаруживали в ассоциации друг с другом. Аналогично скудное представительство характерно для семейства Enterobacteriaceae. Только в 2 случаях их доля в общей микробной массе достигала 0,8%. Во всех пробах обнаружены геномы Escherichia coli, Klebsiella spp. и комплекса Enterobacter cloacae. В 9 случаях лидировали E. coli, в 3 — Klebsiella spp., и еще в 3 случаях данные геномы выявлены в сопоставимых количествах. В 12 пробах обнаружены геномы микроорганизмов рода Citrobacter, но их количество было ничтожно мало.

Обсуждение

Одной из причин снижения фертильности признаются перенесенные специфические урогенитальные инфекции. Как показали результаты нашего исследования, при бесплодии в вагинальном биотопе прослеживаются и заметные изменения в составе нормофлоры: снижается численность лактобактерий, практически элиминируются наиболее полезные, с выраженной антагонистической активностью виды — L. crispatus и L. gasseri, а также расширяется спектр других микроорганизмов, преимущественно УПМ. Зачастую такие события протекают незаметно для пациента. Ранее показано, что предрасположенность к специфическим инфекционно-воспалительным процессам в генитальном тракте связана с избыточным ростом бактерий, прежде всего ассоциированных с БВ, из родов Gardnerella, Atopobium, Prevotella, Bacteroides, Peptostreptococcus, Mobiluncus, Sneathia, Leptotrichia, Mycoplasma и порядка Clostridiales [16]. Однако в настоящем исследовании большинство из них если и были обнаружены, то в минимальных количествах.

Известно, что род Atopobium представлен 4 видами, один из которых тесно связан с развитием БВ [17]. A. parvulum — вид, который обнаруживают преимущественно в ротовой полости [18], однако. по нашим наблюдениям, его генетический материал выделен из влагалища, что косвенно может указывать на широкое распространение нетрадиционных сексуальных практик, что, например, согласуется с данными FM. Lewis и соавт. [19].

С заметным постоянством детектировали фрагменты генома коккобацилл M. osloensis, что оказалось достаточно неожиданным, поскольку эти бактерии являются частью респираторной микрофлоры и относятся к оппортунистическим микроорганизмам, хотя есть сведения об их обнаружении при различных воспалительных процессах, в том числе при вагините [20]. В большинстве случаев упоминается, что пациенты, инфицированные M. osloensis, были иммунокомпрометированными. Описано, что основной метаболит этих бактерий — 4-метил-3-гексеновая кислота — участвует в формировании стойкого неприятного запаха [21]. Среди факторов патогенности M. osloensis описаны продукция экзотоксина, для накопления которого требуется длительная персистенция микроорганизма, а также липополисахарид, фимбрии, предполагается участие капсулы и некоторых адгезинов [22].

При описании лактобактерий как основных участников микробиоты влагалища основное внимание уделяется L. crispatus, которые в настоящем исследовании обнаружены лишь в трети проб и в небольшом количестве. Ведущая позиция принадлежала L. jensenii, которые способны продуцировать биосурфактант с антимикробной активностью в отношении E. coli и Candida albicans и антиадгезивным действием на E. coli, S. saprophyticus и Enterobacter aerogenes [23]. В отношении моракселл таких данных нет. Показано, что L. jensenii являются активным продуцентом перекиси водорода [24], однако есть сведения, что антимикробная активность лактобацилл в большей степени определяется молочной кислотой и бактериоцинами [25]. Более того, тот же вид продуцирует и пероксидазу, которая нивелирует действие перекиси [24]. Кроме этого, L. jensenii отличаются большей активностью D-лактатдегидрогеназы, участвующей в продукции D-оптического изомера молочной кислоты [26], для которого антимикробная активность менее характерна, чем для L-изомера. Несмотря на вполне убедительные иммуномодулирующие эффекты L. jensenii [27], описано участие этого вида в развитии ряда воспалительных заболеваний [28].

В целом, можно предположить, что при развитии бесплодия происходят снижение количества лактобактерий и смена их лидирующего вида. В случае замещения на L. jensenii можно ожидать проявление антагонистических свойств в отношении ряда УПМ, в том числе основных возбудителей БВ, однако в силу малой численности, изменения функциональной активности эффективность воздействия лактофлоры снижается и такие микроорганизмы, как M. osloensis, могут успешно персистировать в вагинальном биотопе. При этом возможна постепенная колонизация и верхних отделов генитального тракта, что влечет за собой репродуктивные проблемы.

Заключение

У включенных в исследование женщин с бесплодием наблюдались бессимптомно протекающие дисбиотические процессы, характеризующиеся рядом особенностей. В вагинальной микробиоте существенно снижается количество представителей рода Lactobacillus. Среди последних доминируют L. jensenii, функциональная активность которых не обеспечивает в полной мере колонизационную резистентность вагинального биотопа, допуская избыточное размножение УПМ, в частности M. osloensis. Прослеженные стойкие нарушения в составе микробиоты влагалища в совокупности с изменениями локальной иммунной реактивности могут становиться причиной снижения фертильности, а в запущенных ситуациях — и утраты репродуктивной функции.

Список литературы

1. Chen C., Song X., Wei W., Zhong H., Dai J., Lan Z., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nat. Commun. 2017; 8(1): 875. DOI: http://doi.org/10.1038/s41467-017-00901-0

2. Stone L. Infection: Vaginal microbiota and infectious infertility. Nat. Rev. Urol. 2018; 15(3): 136. DOI: http://doi.org/10.1038/nrurol.2018.11

3. Ding T., Schloss P.D. Dynamics and associations of microbial community types across the human body. Nature. 2014; 509(7500): 357-60. DOI: http://doi.org/10.1038/nature13178

4. Шишкова Ю.С., Долгушина В.Ф., Графова Е.Д., Завьялова С.А., Курносенко И.В., Евстигнеев а Н.П. и др. Взаимосвязь функционального статуса нейтрофилов цервикального секрета у беременных женщин с видовым составом лактофлоры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(4): 51-6. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-51-56

5. Сычева М.В., Пешкова Ю.И., Карташова О.Л., Андреева А.В. Регуляция антимикробными пептидами чувствительности микроорганизмов к антагонистически активным представителям мутуалистической микрофлоры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(6): 21-5. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-21-25

6. Ma B., Forney L.J., Ravel J. Vaginal microbiome: rethinking health and disease. Annu. Rev. Microbiol. 2012; 66: 371-89. DOI: http://doi.org/10.1146/annurev-micro-092611-150157

7. Sirota I., Zarek S.M., Segars J.H. Potential influence of the microbiome on infertility and assisted reproductive technology. Semin. Reprod. Med. 2014; 32(1): 35-42. DOI: http://doi.org/10.1055/s-0033-1361821

8. Franasiak J.M., Werner M.D., Juneau C.R., Tao X., Landis J., Zhan Y., et al. Endometrial microbiome at the time of embryo transfer: next-generation sequencing of the 16S ribosomal subunit. J. Assist. Reprod. Genet. 2016; 33(1): 129-36. DOI: http://doi.org/10.1007/s10815-015-0614-z

9. Campisciano G., Florian F., D’Eustacchio A., Stanković D., Ricci G., De Seta F., et al. Subclinical alteration of the cervical-vaginal microbiome in women with idiopathic infertility. J. Cell Physiol. 2017; 232(7): 1681-8. DOI: http://doi.org/10.1002/jcp.25806

10. van Oostrum N., De Sutter P., Meys J., Verstraelen H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: a systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. 2013; 28(7): 1809-15. DOI: http://doi.org/10.1093/humrep/det096

11. Михайлова Н.А., Воеводин Д.А., Поддубиков А.В. Коррекция дисбиоза – основа регенеративной медицины. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(5): 107-13. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-107-113

12. Brotman R.M. Vaginal microbiome and sexually transmitted infections: an epidemiologic perspective. J. Clin. Invest. 2011; 121(12): 4610-7. DOI: http://doi.org/10.1172/JCI57172

13. Mastromarino P., Hemalatha R., Barbonetti A., Cinque B., Cifone M.G., Tammaro F., et al. Biological control of vaginosis to improve reproductive health. Indian J. Med. Res. 2014; 140(Suppl.): S91-7.

14. Donati L., Di Vico A., Nucci M., Quagliozzi L., Spagnuolo T., Labianca A., et al. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy. Arch. Gynecol. Obstet. 2010; 281(4): 589-600. DOI: http://doi.org/10.1007/s00404-009-1318-3

15. Богун А.Г., Кисличкина А.А., Галкина Е.В., Майская Н.В., Соломенцев В.И., Мухина Т.Н. и др. Использование современных методов идентификации бактерий в деятельности государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск). Инфекция и иммунитет. 2016; 6(3): 8.

16. Onderdonk A.B., Delaney M.L., Fichorova R.N. The human microbiome during bacterial vaginosis. Clin. Microbiol. Rev. 2016; 29(2): 223-38. DOI: http://doi.org/10.1128/CMR.00075-15

17. Mendes-Soares H., Krishnan V., Settles M.L., Ravel J., Brown C.J., Forney L.J. Fine-scale analysis of 16S rRNA se quences reveals a high level of taxonomic diversity among vaginal Atopobium spp. Pathog. Dis. 2015; 73(4): pii: ftv020. DOI: http://doi.org.10.1093/femspd/ftv020

18. Copeland A., Sikorski J., Lapidus A., Nolan M., Del Rio T.G., Lucas S., et al. Complete genome sequ ence of Atopobium parvulum type strain (IPP 1246). Stand. Genomic Sci. 2009; 1(2): 166-73. DOI: http://doi.org/10.4056/sigs.29547

19. Lewis F.M., Bernstein K.T., Aral S.O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet. Gynecol. 2017; 129(4): 643-54. DOI: http://doi.org/10.1097/AOG.0000000000001932

20. Gómez-Camarasa C., Fernández-Parra J., Navarro-Marí J.M., Gutiérrez-Fernández J. Moraxella osloensis emerging infection. Visiting to genital infection. Rev. Esp. Quimioter. 2018; 31(2): 178-81. (in Spanish)

21. Goto T., Hirakawa H., Morita Y., Tomida J., Sato J., Matsumura Y., et al. Complete genome sequence of Moraxella osloensis strain KMC41, a producer of 4-Methyl-3-Hexenoic acid, a major malodor compound in laundry. Genome Announc. 2016; 4(4): e00705-16. DOI: http://doi.org/10.1128/genomeA.00705-16

22. Tan L., Grewal P.S. Pathogenicity of Moraxella osloensis, a bac terium associated with the nematode Phasmarhabditis hermaphrodita, to the slug Deroceras reticulatum. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(11): 5010-6. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.67.11.5010-5016.2001

23. Morais I.M.C., Cordeiro A.L., Teixeira G.S., Domingues V.S., Nardi R.M.D., Monteiro A.S., et al. Biological and physico chemical properties of biosurfactants produced by Lactobacillus jen senii P6A and Lactobacillus gasseri P65. Microb. Cell Fact. 2017; 16(1): 155. DOI: http://doi.org/10.1186/s12934-017-0769-7

24. Martin R., Suarez J.E. Biosynthesis and degradation of H2O2 by vaginal lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(2): 400-5. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.01631-09

25. O’Hanlon D.E., Moench T.R., Cone R.A. In vaginal fluid, bacteria associated with bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide. BMC Infect. Dis. 2011; 11: 200. DOI: http://doi.org/10.1186/1471-2334-11-200

26. Kim S., Gu S.A., Kim Y.H., Kim K.J. Crystal structure and thermodynamic properties of d-lactate dehydrogenase from Lactobacillus jensenii. Int. J. Biol. Macromol. 2014; 68: 151-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.04.048

27. Tsukida K., Takahashi T., Iida H., Kanmani P., Suda Y., Nochi T., et al. Immunoregulatory effects triggered by immunobiotic Lactobacillus jensenii TL2937 strain involve efficient phagocytosis in porcine antigen presenting cells. BMC Immunol. 2016; 17(1): 21. DOI: http://doi.org/10.1186/s12865-016-0160-1

28. Patnaik S., Davila C.D., Chennupati A., Rubin A. Endocarditis of the native aortic valve caused by Lactobacillus jensenii. BMJ Case Rep. 2015; 2015: bcr2014206288. DOI: http://doi.org/10.1136/bcr-2014-206288


Об авторах

А. П. Годовалов
ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России
Россия

Годовалов Анатолий Петрович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии с курсом вирусологии



Т. И. Карпунина
ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России
Россия

Карпунина Тамара Исаковна — доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии с курсом вирусологии



Рецензия

Просмотров: 1720


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)