Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Влияние иммунизации кроликов дрожжевыми антигенами на активность фракции сывороточных антимикробных пептидов

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-1-19-25

Полный текст:

Аннотация

Введение. Установлено, что иммунизация мышей дрожжевыми антигенами сопровождается повышением активности фракции антимикробных пептидов (АМП) по отношению к Candida albicans.  Неизвестно, обладает ли эта фракция специфичностью по отношению к прочим видам дрожжей.

Цель работы — изучить влияние иммунизации кроликов разными видами дрожжей на общую антимикробную активность сыворотки и специфическую активность фракции ее АМП.

Материал и методы. Кроликов иммунизировали клетками дрожжей Candida albicans, Rhodotorula mu cilaginosa, Malassezia furfur, Cryptococcus neoformans, Geotrichum candi dum, Trichosporon cuta neum, Saccharomyces cerevisiae. Фракции АМП получали фильтрацией сывороток через фильтры с диаметром пор 100 кД. Общую активность сывороток и их АМП-фракций оценивали спектрофотометрически.

Результаты. Общая активность сывороток под действием иммунизации имела тенденцию к снижению независимо от вида дрожжей. Активность АМП-фракций под действием C. albicans, Cr. neoformans, G. candidum и S. cerevisiae возрастала, а под действием прочих — снижалась. Наиболее высокая чувствительность к АМП-фракции сывороток соответствовала C. albicans, особенно в отношении сыворотки кролика, иммунизированного этими же дрожжами, — в 1,5 раза выше контроля. Концентрация альбумина в сыворотках имела положительную корреляцию с общей активностью против C. albicans (r = 0,760), R. mucilaginosa (r = 0,728), M. furfur (r = 0,723) и T. cutaneum (r = 0,588).

Обсуждение. Результаты экспериментов не только согласуются с полученными ранее данными, но и расширяют представления о воздействии дрожжевых антигенов на активность сывороточных АМП против разных видов дрожжей.

Заключение. Альбумин сыворотки и сывороточные АМП обладают специфичностью в отношении разных микроорганизмов, причем наибольшую активность они проявляют в отношении тех видов, которые чаще выступают в роли условных патогенов.

Введение

Прямым противомикробным действием сыворотки крови млекопитающих обладают белки системы комплемента, иммуноглобулины и антимикробные пептиды (АМП). При различных механизмах это действие выражается в повреждении клеточной мембраны патогенных микроорганизмов [1]. На основании данного свойства разработан способ оценки общей противомикробной активности сыворотки крови и ее низкомолекулярной фракции (2,8-80 кД), в которую входят АМП [2]. Данный способ заключается в действии образцов сыворотки на клетки тест-культур микроорганизмов и спектрофотометрическом измерении процента красителя, вошедшего в убитые клетки, по сравнению с контролем. С помощью этого метода определены указанные свойства сывороток 4 видов млекопитающих, включая человека, и обнаружены различия в величинах противогрибковой активности (ПГА) АМП-фракций сывороток, но не в величинах общей активности [3]. Этим же методом показано. что иммунизация мышей дрожжевыми антигенами приводила не только к увеличению уровней специфических иммуноглобулинов класса G, но и к повышению активности фракции АМП по отношению к Candida albicans [4].

Целью исследования явилось изучение влияния иммунизации кроликов клетками разных видов условно-патогенных дрожжевых грибов на общую антимикробную активность сыворотки и специфическую активность фракции ее АМП.

Материал и методы

Опытная группа кроликов состояла из 7 здоровых самок породы шиншилла массой 1,5 кг, полученных из питомника ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России, филиал «Андреевка». Контрольную группу составляли 4 таких же кролика. Эксперименты проводили в соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33217-2014).

Штаммы дрожжей Candida albicans № 927, Rhodotorula mucilaginosa № 132, Malassezia furfur № 1451, Cryptococcus neoformans № 3465, Geotrichum candidum № 1206, Trichosporon cutaneum № 18 получены из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова; а Saccharomyces cerevisiae Y-375 — из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Суспензии клеток для иммунизации и прочих опытов готовили из экспоненциальных культур, выращенных на плотной среде Сабуро при 25°С (в случае M. furfur — на модифицированной среде Диксона при 32°С).

Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: каждого кролика из опытной группы иммунизировали суспензией убитых мертиолятом клеток одной из культур дрожжей плотностью 1010 КОЕ/мл в объеме 1 мл, внутримышечно (в бедро), 8-кратно в течение 2 мес. Сыворотки получали от всех кроликов одновременно, включая контрольную группу, лиофильно высушивали, определяли плотность путем взвешивания сухих остатков и соотнесения с объемами исходных сывороток, после чего хранили при 5°С. Для проведения каждого эксперимента с одним видом дрожжей взвешивали часть сыворотки, разводя ее до исходной плотности дистиллированной стерильной водой.

Фракции, содержащие АМП, получали путем фильтрования сывороток через молекулярные фильтры «Amicon Ultra» («Millipore», «Merck») с диаметром пор 100 кД на центрифуге в течение 15 мин при 16 000 об/мин. ПГА определяли по схеме: аликвоты сывороток или их АМП-фракций объемом 150 мкл (контрольная пробирка содержала физиологический раствор) соединяли с 50 мкл суспензии дрожжей в пробирках типа Эппендорф, инкубировали 2 ч при 32°С на шейкере, затем центрифугировали 5 мин при 16 000 об/мин, супернатанты удаляли, а к осадкам добавляли по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном буфере рН 4,6. Смесь суспендировали, инкубировали 45 мин при 32°С на шейкере, затем суспензии вновь центрифугировали и по 50 мкл полученных супернатантов добавляли в заранее подготовленные пробирки, содержащие по 2,5 мл фосфатного буфера рН 4,6. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре «Genesys 10S UV-Vis» при длине волны 440 нм в кюветах толщиной 1 см. Активность рассчитывали в процентах по отношению к контрольному образцу [5].

Метод определения концентрации сывороточного альбумина основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента. К 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз, добавляли 4 мл реактива, содержащего бромкрезоловый зеленый и детергент Triron Х-100 в ацетатном буфере («Альбумин Агат», «Агат», Россия); инкубацию проводили в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете толщиной 1 см. Калибровочные растворы делали на основе человеческого сывороточного альбумина («Reanal», Чехия). Прямая зависимость оптической плотности от концентрации альбумина имела место в диапазоне концентраций 0,3-20 мг/мл.

Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel. Коэффициенты МаннаУитни, свидетельствующие о наличии/отсутствии значимости различий между показателями, рассчитывали с помощью автоматической программы1. В качестве показателя корреляционных взаимосвязей использовали коэффициент Пирсона (г).

Результаты

В табл. 1 приведены медианы величин общей ПГА сывороток, полученных при иммунизации кроликов дрожжевыми антигенами, и контрольных («чистых») кроликов. Сравнение данных величин показывает наличие прямой корреляции высокой степени между общей активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) против разных видов дрожжей. Кроме того, если сравнивать те же величины (верхний ряд) с активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), то обнаруживается также высокая положительная корреляция (г = 0,819). Несмотря на то что достоверность различий в величинах общей активности между выборками неиммунизированных и иммунизированных кроликов не в каждом случае высока, векторы изменения общей ПГА для всех изучаемых микроорганизмов одинаковы — тенденция к снижению активности в результате иммунизации.

 

Таблица 1. Изменение общей ПГА сыворотки кроликов в ответ на иммунизацию дрожжевыми клетками

Table 1. Change in total rabbit serum PHA in response to yeast cell immunization

Сыворотки кроликов

Rabbit serum

Активность сывороток против следующих культур дрожжей, % (медианы)

Serum activity against the following yeast cultures,% (median)

Корреляция с общей активностью неиммунизированных кроликов

Correlation with total activity non-immunized rabbits

C. albicans

R. mucilaginosa

M. furfur

Cr. neoformans

G. candidum

T. cutaneum

S. cerevisiae

Неиммунизированных*

Non-immunized

Иммунизированных клетками: Cell immunized:

83,9

68,4

75,8

71,3

64,4

76,5

76,3

 

С. albicans

77,7

59,3

64,6

71,7

60,5

72,7

75,8

0,820

R. mucilaginosa

75,0

42,5

52,5

66,5

53,2

47,8

70,4

0,575

М. furfur

81,0

65,1

69,1

70,8

69,8

69,9

75,4

0,760

Cr. neoformans

82,5

53,1

55,2

41,2

58,4

54,2

69,6

0,644

G. candidum

84,3

58,3

68,2

66,6

63,2

68,5

69,1

0,883

T. cutaneum

76,9

64,0

76,1

67,2

70,2

75,1

69,4

0,703

S. cerevisiae

82,7

62,3

83,5

72,6

62,2

55,3

56,5

0,417

Достоверность различий** Significance**

p ≥ 0,05

p ≤ 0,01

p ≥0,05

p ≤ 0,01

p ≥ 0,05

p ≥0,05

p ≤ 0,01

 

Вектор изменения общей активности в результате иммунизации

The vector of change in overall activity as a result of immunization

 

Примечание. 'Медиана из 4 значений. "Достоверность различий между выборкой неиммунизированных и иммунизированных кроликов.

Note. * Median of 4 values. ** Significance of differences between the sample of non-immunized and immunized rabbits.

 

В табл. 2 приведены медианы величин ПГА фракции сывороточных антимикробных пептидов кроликов в ответ на иммунизацию дрожжевыми клетками. Видно, что, в отличие от величин общей активности, эти величины менялись значительно, о чем свидетельствуют значения коэффициентов Манна-Уитни. Однако прямая корреляция высокой силы между АМП-активностью сыворотки иммунизированных кроликов (горизонтальные ряды) и общей активностью неиммунизированных животных (верхний ряд) также имела место. Сравнение тех же величин (верхний ряд) с АМП-активностями сывороток иммунизированных кроликов против тех же культур, которыми они были иммунизированы (числа, выделенные жирным шрифтом), показало также наличие высокой положительной корреляции (г = 0,687). В отличие от общей активности векторы изменения АМП-активностей зависели от вида дрожжей: в случае иммунизации S. cerevisiae, G. candidum, Cr. neoformans и C. albicans имело место повышение данного показателя, тогда как после иммунизации R. mucilaginosa, M. furfur и T. cutaneum — снижение.

 

Таблица 2. Изменение ПГА фракции сывороточных антимикробных пептидов кроликов в ответ на иммунизацию дрожжевыми клетками

Table 2. The change in antifungal activity of fractions of serum antimicrobial peptides of rabbits in response to immunization with yeast cells

Сыворотки кроликов

Rabbit serum

Активность сывороток против следующих культур дрожжей, % (медианы)

Корреляция с АМП-активностью неиммунизированных кроликов

Correlation with the AMP activity of non-immunized rabbits

C. albicans

R. mucilaginosa

М. furfur

Cr. neoformans

G. candidum

Т. cutaneum

S. cerevisiae

Неиммунизированных*

Non-immunized

Иммунизированных клетками:

Cell immunized:

35,2

34,2

14,1

28,5

8,0

22,0

15,2

 

C. albicans

51,4

46,5

15,1

46,3

11,8

51,2

22,0

0,899

R. mucilaginosa

33,8

15,3

17,0

41,0

4,9

7,3

12,2

0,672

M. furfur

30,7

41,7

11,5

32,4

0

36,4

20,5

0,858

Cr. neoformans

39,6

43,5

20,0

34,3

15,1

8,6

10,1

0,816

G. candidum

39,6

40,6

11,2

35,4

10,0

31,7

19,0

0,965

T. cutaneum

38,3

30,3

10,7

32,9

7,4

9,6

8,6

0,917

S. cerevisiae

34,0

31,4

21,4

37,9

13,8

17,7

20,3

0,865

Достоверность различий** Significance**

p ≤ 0,01

р ≤ 0,01

р ≤ 0,01

р ≤ 0,01

р ≤ 0,01

р ≤ 0,01

p ≥ 0,05

 

Вектор изменения активности АМП-фракции в результате иммунизации

The vector of changes in the activity oftheAMP fraction as a result of immunization

 

Примечание. 'Среднее из 4 значений. "Достоверность различий между выборкой неиммунизированных и иммунизированных кроликов.

Note. * Median of 4 values. ** Significance of differences between the sample of non-immunized and immunized rabbits.

Интересно отметить, что значения общей активности сыворотки иммунизированных кроликов против данной культуры не коррелировали с таковыми для АМП-активности (г = -0,006).

Концентрацию альбумина определяли во всех сыворотках: медиана для неиммунизированных кроликов равна 86,9 мг/мл, а для иммунизированных — 83,1 мг/мл. Различия между выборками недостоверны: p > 0,05. Сравнение величин концентрации альбумина и общей активности сывороток против разных видов дрожжей по всей выборке иммунизированных и неиммунизированных кроликов дало следующие коэффициенты корреляции: для C. albicans — 0,760; для R. mucilaginosa — 0,728; для M. furfur — 0,723; для Cr. neoformans — 0,316; для G. candidum — 0,432; для T. cutaneum — 0,588 и для S. cerevisiae — 0,056.

Обсуждение

Дрожжевые грибы родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula и Trichosporon имеют большое значение в клинической практике, а такие роды, как Geotrichum и Saccharomyces, часто встречаются в продуктах питания [7]. Дрожжи рода Malassezia являются нормальными обитателями кожи теплокровных животных, но при иммунодефиците вовлекаются в патологические процессы [8]. Хорошо известно, что на введение чужеродного антигена организм отвечает повышением уровней специфических иммуноглобулинов. Публикаций о влиянии иммунизации на АМП чрезвычайно мало. Есть данные об индукции эпителиального бета-дефензина-3 в результате иммунизации мышей живыми клетками Pseudomonas aeruginosa [9]. На группе здоровых добровольцев, получавших живые аттенуированные бактериальные вакцины, показано подавление экспрессии эпителиального кишечного альфа-дефензина [10]. При иммунизации мышей антигенами разных видов дрожжей наблюдали увеличение специфических иммуноглобулинов наряду с повышением активности АМП-фракции сывороток животных по отношению к одному виду дрожжей, а именно C. albicans [4].

В настоящей работе оценивали не только активность АМП-фракций сыворотки против C. albicans в результате иммунизации животных, но и ту же активность против других значимых видов дрожжей, а также общую ПГА сывороток. Оказалось, что общая ПГА сывороток под действием иммунизации менялась незначительно, однако имела тенденцию к снижению независимо от вида дрожжей. В то же время активность АМП-фракций сывороток варьировала гораздо сильнее, при этом имела место зависимость от вида дрожжевых грибов: под действием C. albicans, Cr. neoformans, G. candidum и S. cerevisiae она значительно возрастала, а под действием прочих — снижалась. Обращает на себя внимание тот факт, что общая активность сывороток (и активность их АМП-фракций) у «чистых» и иммунизированных кроликов коррелировала между собой, что свидетельствует о некоторой специфичности по отношению к разным видам испытуемых дрожжей. Наиболее высокая чувствительность к АМП-фракции сывороток характерна для C. albicans, особенно в отношении сыворотки кролика, иммунизированного этими же дрожжами. Очевидно, что наибольшую активность АМП-фракции организм проявляет в отношении грибов, наиболее часто выступающих в качестве возбудителя микозов. Именно их антигены, попадая в организм животного, вызывают повышение иммунного ответа не только в виде специфических иммуноглобулинов, но и в виде комплекса АМП. Напротив, наименьшую активность организм проявляет по отношению к представителям нормобиоты и видам, поступающим с пищевыми продуктами.

Недавно установлено, что сывороточный альбумин в физиологических концентрациях (порядка 50 мг/мл и выше) обладает непосредственным антимикробным действием на клетки дрожжевых грибов и бактерий, проявляя при этом дозозависимый эффект [10]. Определение концентрации альбумина в настоящем исследовании показало отсутствие существенных различий в этих показателях у иммунизированных и неиммунизированных животных. Однако для некоторых видов дрожжей наблюдалась корреляция между концентрацией альбумина и общей активностью сыворотки. Величина коэффициента корреляции Пирсона убывала в ряду: C. albicans — R. mucilaginosa — M. furfur — T. cutaneum — G. candidum — Cr. neoformans — S. cerevisiae. Наиболее высокой взаимосвязь между общей ПГА сыворотки и концентрацией альбумина была в случае дрожжей C. albicans.

Заключение

Альбумин сыворотки, как и АМП, обладает специфичностью в отношении разных дрожжевых грибов, причем наибольшую активность они проявляют в отношении тех видов, которые чаще выступают в роли условных патогенов.

Список литературы

1. Zasloff M. Antimicrobial peptides in health and disease. N. Engl. J. Med. 2002; 347(15): 1199-200. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMe020106

2. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Артемьева Т.А., Бутовченко Л.М., Вартанова Н.О., Ерофеева Т.В. и др. Способ определения противомикробной активности цельной сыворотки и фракции ее антимикробных пептидов. Патент РФ № 2686337С1; 2018.

3. Арзуманян В.Г., Артемьева Т.А., Иксанова А.М. Противогрибковая активность сыворотки крови человека и некоторых млекопитающих. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; (1): 17-22. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-17-22

4. Arzumanian V., Shmeleva O., Michailova N. Elevated activity levels of serum antimicrobial peptides in mice as response to immunization with yeast antigens. Med. Mycol. Open Access. 2017; 3(1): 23. DOI: http://doi.org/10.21767/2471-8521.100023

5. Арзуманян В.Г., Ожован И.М. Модифицированный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002; 134(7): 118-20.

6. Арзуманян В.Г., Шмелева О.А. Клинически значимые дрожжевые грибы — классификация, антигены и современные методы диагностики. В кн.: Дьяков Ю.Т., Сергеев А.Ю., ред. Микология сегодня. Том III. М.: Национальная академия микологии; 2016: 116-39.

7. Арзуманян В.Г. Дрожжи рода Malassezia: таксономия, идентификация, значение в экологии и патологии человека. В кн.: Дьяков Ю.Т., Сергеев Ю.В., ред. Новое в систематике и номенклатуре грибов. М.: Медицина для всех; 2003: 458-92.

8. Bals R., Wang X., Meegalla R.L., Wattler S., Weiner D.J., Nehls M.C., et al. Mouse beta-defensin 3 is an inducible antimicrobial peptide expressed in the epithelia of multiple organs. Infect. Immun. 1999; 67(7): 3542-7.

9. Simuyandi M., Kapulu M., Kelly P. Anti‐microbial peptide gene expression during oral vaccination: analysis of a randomized controlled trial. Clin. Exp. Immunol. 2016; 186(2): 205-13. DOI: http://doi.org/10.1111/cei.12848

10. Арзуманян В.Г., Ожован И.М., Свитич О.А. Антимикробное действие альбумина на клетки бактерий и дрожжей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019; 167(6): 722-5.


Об авторах

В. Г. Арзуманян
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»
Россия

Арзуманян Вера Георгиевна — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией физиологии грибов и бактерий

105064, Москва



А. М. Иксанова
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»
Россия

Иксанова Асия Мунировна — лаборант-исследователь лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва



T. А. Артемьева
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»
Россия

Артемьева Тамара Алексеевна — ведущий технолог лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва



Л. М. Бутовченко
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»
Россия

Бутовченко Любовь Михайловна — ведущий инженер лаборатории физиологии грибов и бактерий

105064, Москва



Рецензия

Просмотров: 433


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)