Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Антигенная и генетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными пневмококковыми инфекциями, с использованием высокопроизводительного секвенирования

https://doi.org/10.36233/0372-9311-144

Полный текст:

Аннотация

Цель работы заключалась в характеристике и сопоставлении данных об антигенных и генетических свойствах полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными формами пневмококковой инфекции (ПИ). Материалы и методы. Исследовано 158 штаммов S. pneumoniae, выделенных при проведении различных этапов многоцентрового исследования «ПеГАС» в 2015-2020 гг. При анализе данных использовалась информация о полногеномных последовательностях 46 штаммов, выделенных ранее в том же исследовании. Для определения серотипов применены методики ПЦР в режиме реального времени и высокопроизводительное секвенирование (платформа «Illumina»). При обработке данных использовались программы «SeroBA», «PneumoCaT» и программные возможности интернет-ресурса PubMLST.org.
Результаты и обсуждение. Определены серотипы всех штаммов, включённых в исследование. Найден ряд несовпадений серотипов внутри серогруппы 6 и один дискордантный результат при анализе полногеномных последовательностей двумя программами. Предлагаемые ПЦР-подходы позволяют охарактеризовать серотип у 87% возбудителей инвазивных и 69% неинвазивных форм ПИ. Доля штаммов с серотипами, входящими в состав PCV13, составляет 59 и 37%, в состав PPV23 — 78 и 53% для штаммов, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными ПИ соответственно. Анализ данных не позволяет выявить преобладающий сиквенс-тип (всего найден 81 сиквенс-тип) или определить клональные комплексы, за исключением штаммов серотипа 3, что согласуется с полученными ранее данными об отсутствии выраженной клональной структуры S. pneumoniae, ассоциированных с пневмококковыми менингитами, на территории России.
Заключение. Получены данные, позволяющие определить распределение циркулирующих серотипов и генетические характеристики штаммов, выделенных от больных ПИ, что даёт возможность оценить эффективность существующих поливалентных вакцин и предоставляет информацию для коррекции основанных на ПЦР способов серотипирования.

Введение

Streptococcus pneumoniae является одним из распространённых патогенов человека, способных вызывать инфекции различной локализации. Клинически принято выделять инвазивные и неинвазивные пневмококковые инфекции (ПИ) [1]. К инвазивным формам относят инфекции, при которых возбудитель выделен из стерильных в норме локусов (например, кровь или спинномозговая жидкость). К неинвазивным формам относят в том числе небактериемические пневмонии, при которых возбудитель может быть выделен из отделяемого нижних дыхательных путей. В этой связи далее в статье инвазивными и неинвазивными штаммами будут обозначены культуры микроорганизмов, выделенные от больных соответствующими формами ПИ.

Важным элементом эпидемиологического надзора за ПИ является микробиологический мониторинг, включающий антигенную и генетическую характеристики возбудителей ПИ, а также данные о чувствительности к антибиотикам. Антигенная характеристика возбудителей заключается в определении серотипов, что позволяет оценить эффективность существующих поливалентных вакцин. В России широкое применение получили 13-валентная конъюгированная пневмококковая вакцина (PCV13, «Превенар 13») и 23-валентная полисахаридная вакцина (PPV23, «Пневмовакс 23»). Определение спектра серотипов возбудителей ПИ позволяет планировать иммунопрофилактические мероприятия и оценивать их эффективность в группах лиц, вовлечённых в эпидемический процесс.

Если чувствительность к антибиотикам оценивается, согласно рекомендациям EUCAST [2][3], с использованием стандартных микробиологических методов и, в связи с многообразием механизмов резистентности [1], она не всегда может быть исследована с использованием молекулярно-биологических методов, то эффективность использования молекулярно-биологических методов для определения серогрупп и серотипов (ключевой элемент антигенной характеристики S. pneumoniae) была неоднократно показана в отечественных и зарубежных исследованиях [4–7]. Определение генетических свойств штаммов S. pneumoniae с использованием мультилокусного секвенирования типирования (МЛСТ) или других подходов, основанных на анализе полногеномных данных, позволяет описать клональную структуру микроорганизмов, вовлечённых в эпидемический процесс, оценить рекомбинационный потенциал бактериальной популяции и охарактеризовать эволюционные процессы, приводящие к возникновению новых потенциально вирулентных или резистентных к антибиотикам штаммов [1][8–10].

Антигенная и генетическая характеристики могут быть определены с использованием молекулярно-биологических методов, таких как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) и секвенирование. Применение высокопроизводительного секвенирования позволяет получить исчерпывающую характеристику микроорганизмов на основании анализа их полногеномных сиквенсов: последовательностей генов cps-локуса для определения серотипов и данных о первичных последовательностях локусов «основного генома» (core genome), анализ которых обладает максимальной дискриминирующей способностью для определения генетических взаимоотношений штаммов и определения клональной структуры бактериальной популяции. Несмотря на очевидные преимущества ПЦР-РРВ для определения серотипов, эффективность её применения не всегда очевидна, что обусловлено постоянной адаптацией возбудителей под давлением популяционного иммунитета, в том числе обусловленного иммунопрофилактикой с использованием поливалентных вакцин. К настоящему времени известно не менее 100 серотипов S. pneumoniae, из которых значительная часть ассоциирована с инвазивными ПИ [1][11], что диктует необходимость изучения штаммов, не типируемых с помощью стандартных серологических или основанных на ПЦР методик, с целью оптимизации существующих лабораторных подходов, например, за счёт использования дополнительных серотип-специфических мишеней, и даёт информацию об эпидемиологических особенностях циркулирующих возбудителей для эффективного планирования и контроля эффективности программ по вакцинации.

В связи с этим цель данного исследования заключалась в характеристике с помощью высокопроизводительного секвенирования штаммов S. pneumoniae, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными формами ПИ, сравнительном анализе их антигенных и генетических свойств в контексте проводимого микробиологического мониторинга.

Материалы и методы

Проведено исследование 22 инвазивных штаммов (выделены из крови или спинномозговой жидкости) и 90 неинвазивных штаммов (выделены из мокроты больных внебольничными пневмониями пневмококковой этиологии) S. pneumoniae. Все штаммы были получены при проведении различных этапов многоцентрового исследования «ПеГАС» в 2015–2020 гг. [2]. Большинство штаммов, охарактеризованных в данном исследовании, и инвазивные штаммы, также полученные при проведении исследования «ПеГАС» и охарактеризованные ранее [5], были выделены в 2019 (n = 58) и 2020 гг. (n = 47).

Условия транспортировки и хранения, микробиологические методы, методы видовой идентификации, методика выделения ДНК, процедура полногеномного секвенирования и сборки генома описаны ранее [2][5]. Все штаммы были дополнительно исследованы с использованием методики ПЦР-РРВ для определения 16 серотипов [4] и с помощью дополнительно разработанной методики для определения серотипов 12F, 15BC, 22FA и 8. Реакционные смеси для ПЦР-РРВ содержат набор из 4 серотип-специфических олигонуклеотидов, соответствующих группам, представленным в табл. 1. Для определения серотипов на основе данных полногеномного секвенирования использовали программы «SeroBA» [6] и «PneumoCaT» [7].

Депонирование нуклеотидных последовательностей, обработка результатов секвенирования с обозначением аллелей и сиквенс-типов, а также анализ данных МЛСТ с помощью программных модулей BURST и Genome Comparator проводили с использованием интернет-ресурса PubMLST.org1[9]. На момент окончания исследования база данных содержала информацию о более чем 37 тыс. геномов S. pneumoniae, включая 288 полногеномных последовательностей российских изолятов, охарактеризованных преимущественно в работах [5][10]. Поскольку ранее нами была исследована выборка из 46 инвазивных штаммов, также выделенных в рамках исследования «ПеГАС», при сопоставлении результатов антигенной и генетической характеристик инвазивных и неинвазивных штаммов использована объединённая выборка инвазивных штаммов (n = 68), включающая штаммы, описанные нами ранее [5].

Результаты

Полногеномные нуклеотидные последовательности изученных штаммов, данные о серотипах и чувствительности к антибиотикам (для большинства штаммов), а также информация об источниках штаммов внесены в базу PubMLST, идентификационные номера (id): инвазивные штаммы — 73010, 73011, 73013–73015, 73017–73033, неинвазивные штаммы — 142542, 142543, 142546–142569, 142572–142574, 142578, 142579, 142581, 142583–142604, 142606 142610, 142612–142625, 142627–142643. Для всех штаммов определены аллельные профили и соответствующие им сиквенс-типы, при этом часть аллелей и сиквенстипов были описаны впервые.

В результате анализа полногеномных данных с использованием двух программ [6][7] удалось определить серотиповую принадлежность всех изученных штаммов. При этом у неинвазивных штаммов наблюдались несовпадения при определении серотипов, принадлежащих серогруппам 6 (определялись серотипы В или С, А или В и D или С), у 5 штаммов, 15 (В или С) — у 3 штаммов и 35 (А или С) — у 1 штамма, однократно был получен дискордантный результат: у изолята id142633 серотип определён неоднозначным образом (35A или 42). Несоответствий между определением серотипов in silico и при использовании методик ПЦР-РРВ для определения серотипов не выявлено.

Обсуждение

Антигенная характеристика

Всего у инвазивных и неинвазивных штаммов было найдено 28 и 33 варианта серотипов соответственно (неповторяющихся — 42). Наиболее часто (более чем у 5%) у инвазивных штаммов были найдены серотипы 3 (18%), 19F (9%) и 23F (7%), у неинвазивных — 3 (11%), 19F (10%), 15С (8%) и 11A (8%), 23F (7%) и 23A (6%). В табл. 1 представлены данные о частотах серотипов, разделённых по группам, для обеих выборок штаммов. Группам серотипов соответствуют серотип-специфические мишени, детектируемые методиками ПЦР-РРВ, и капсульные антигены, входящие в состав поливалентных вакцин PCV13 и PPSV23. Как следует из табл. 1, доля штаммов, серотип которых может быть определён с помощью методики ПЦР-РРВ для 16 серотипов [4], включающей все серотипы вакцины PCV13, составляет 67% для инвазивных штаммов и 53% для неинвазивных. Эти значения соответствуют доле определённых серотипов (65%), полученных при исследовании возбудителей пневмококкового менингита, циркулирующих на территории Москвы в сопоставимый промежуток времени (2016–2019 гг.) [12], и ниже (79%) циркулирующих ранее (2007–2010 гг.) [4]. Уменьшение доли серотипов, входящих в состав вакцины PCV13, может объясняться как изменяющимся спектром антигенного разнообразия S. pneumoniae, связанным с вакцинацией, так и территориальным разнообразием возбудителей, включённых в данное исследование и изученных при проведении различных этапов исследования «ПеГАС» [2]. Детекция дополнительных серотип-специфических мишеней 12F, 15BC, 22FA и 8 позволяет повысить долю определяемых серотипов до 87 и 69%, при этом наблюдается статистически значимое различие между выборками. Разработанная в 2014 г. методика ПЦРРРВ и предложенный алгоритм её использования [4] не оптимальны как для инвазивных, так и для неинвазивных штаммов в охарактеризованной выборке, собранной на территории нескольких регионов России и циркулирующей преимущественно в 2019–2020 гг. Оптимальный способ определения серотипов методом ПЦР-РРВ должен включать дополнительные серотип-специфические мишени 12F, 15BC, 22FA и 8, при этом детекция серотипов 2, 5, 7AF и 19A может не проводиться.

Таблица 1. Группы серотипов, выявленные у инвазивных и неинвазивных штаммов
Table 1. Serotype groups identified in invasive and non-invasive strains


Примечание. *χ2 Пирсона с поправкой Йейтса; **точный тест Фишера, p-value.
Note. *χ2 of Pearson with Yates correction; **Fisher's exact test, p-value.

Доля серотипов, входящих в вакцины PCV13 и PPSV23, для исследованных выборок штаммов различна, при этом доля входящих в вакцины серотипов статистически значимо выше в выборке инвазивных штаммов для обеих вакцин.

Генетическая характеристика

У изученных штаммов в совокупности с результатами исследования [5] был выявлен 81 сиквенстип, из которых наиболее часто встречались ST180 (6%), ST-505 (5%), ST-1025, ST-1262 и ST-6202 (по 4%), ST-81 и ST-239 (по 3%). В обеих выборках штаммов максимальное количество сиквенс-типов было выявлено однократно. Из 81 сиквенс-типа 18 (22%) встречались в обеих выборках штаммов, 27 (33%) сиквенс-типов — только у инвазивных штаммов и 36 (44%) — только у неинвазивных. Часть различий в распределении и частотах найденных сиквенс-типов представлена в табл. 2.

Таблица 2. Сиквенс-типы инвазивных и неинвазивных штаммов, выявленные в 2 и более случаях
Table 2. Sequence types of invasive and non-invasive strains identified in 2 or more cases


Примечание. *Жирным шрифтом выделены сиквенс-типы, найденные в обеих выборках.
Note. *Sequence types found in both samples are in bold.

Несмотря на различия в составе и количестве найденных сиквенс-типов у исследованных инвазивных и неинвазивных штаммов, индекс разнообразия по Симпсону, рассчитанный согласно [13], не отличается и составляет 98,3 и 98,5% соответственно. С одной стороны, полученные высокие значения индекса разнообразия не позволяют говорить о выраженной клональной структуре исследованных возбудителей, с другой — проведённый анализ данных МЛСТ методом BURST определяет две группы генетически близких штаммов с центральными сиквенс-типами ST-311 и ST-505 (при условии объединения в группу штаммов, имеющих не более 2 несовпадений в аллельном профиле). Группа ccST-311 объединяет 9 штаммов с сиквенс-типами ST-36, ST-42, ST15248, ST-16095 и ST-16358, все они принадлежат серогруппе 23 (серотипы A или F). Группа ccST-505 объединяет 20 штаммов серотипа 3 с сиквенс-типами ST-180, ST-2049, ST-15250 и ST-15251, при этом инвазивные штаммы имеют сиквенс-тип ST-180, а неинвазивные — ST-505 (табл. 2). Группе ccST-505 соответствует обозначенная в исследовании [3] клональная группа СС180 — один из наиболее распространённых в России клональных комплексов S. pneumoniae, выделенных в 1980–2017 гг.

При сопоставлении найденных сиквенс-типов с сиквенс-типами 81 российского штамма S. pneumoniae (39 сиквенс-типов), выделенных от больных менингитом в 2011–2015 гг. и охарактеризованных в исследовании [10], найдено 12 совпадений, при этом различий в количестве совпадений между выборками инвазивных и неинвазивных штаммов не наблюдалось. Проведённый анализ по «основному геному» (cgMLST), включающий расчёт генетического расстояния по 1367 локусам, позволяет обозначить обособленные группы штаммов определённых серотипов (для наиболее распространённых серотипов: 3, 19F, 11А, 15BC и 9V), в то же время некоторые группы содержат штаммы нескольких серогрупп (например, 10А и 6С). Сопоставление результатов двух исследований и проведённая генетическая характеристика подтверждают сформулированные ранее положения об отсутствии выраженной клональной структуры S. pneumoniae, ассоциированных с инвазивными ПИ, на территории России [5].

Использование полногеномного секвенирования в молекулярно-биологическом мониторинге возбудителей ПИ позволяет своевременно получать достоверные данные об изменениях в структуре циркулирующих серотипов S. pneumoniae, что может быть эффективно использовано при планировании и оценке эффективности иммунопрофилактических мероприятий. Основанная на полногеномных данных генетическая характеристика является эффективным инструментом внутривидовой классификации возбудителей, проводимой с целью расширенного микробиологического мониторинга как элемента эпидемиологического надзора за ПИ. Накопление и анализ полногеномных данных в перспективе позволит расширить представления об основных генетических вариациях, ассоциированных со способностью отдельных представителей вида S. pneumoniae вызывать инвазивные формы ПИ.

1. PubMLST. Streptococcus pneumoniae MLST Databases. URL: https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-pneumoniae

Список литературы

1. Козлов Р.С. Пневмококки: уроки прошлого — взгляд в будущее. Смоленск; 2010.

2. Иванчик Н.В., Чагарян А.Н., Сухорукова М.В., Козлов Р.С., Дехнич А.В., Кречикова О.И. и др. Антибиотикорезистентность клинических штаммов Streptococcus pneumoniae в России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «ПеГАС 2014-2017». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(3): 230-7. https://doi.org/10.36488/cmac.2019.3.230-237

3. Цветкова И.А., Беланов С.С., Гостев В.В., Калиногорская О.С., Волкова М.О., Мохов А.С. и др. Клональная структура популяции изолятов Streptococcus pneumoniae, циркулирующих в России с 1980 по 2017 гг. Антибиотики и химиотерапия. 2019; 64(5-6): 22-31. https://doi.org/10.24411/0235-2990-2019-10027

4. Миронов К.О., Платонов А.Е., Дунаева Е.А., Кусева В.И., Шипулин Г.А. Методика ПЦР в режиме реального времени для определения серотипов Streptococcus pneumoniae. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 91(1): 41-8.

5. Миронов К.О., Корчагин В.И., Михайлова Ю.В., Янушевич Ю.Г., Шеленков А.А., Чагарян А.Н. и др. Характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных инвазивными пневмококковыми инфекциями, с использованием высокопроизводительного секвенирования. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(2): 113-8. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-113-118

6. Epping L., van Tonder A.J., Gladstone R.A., Bentley S.D., Page A.J., Keane J.A. The Global Pneumococcal Sequencing Consortium. SeroBA: rapid high-throughput serotyping of Streptococcus pneumoniae from whole genome sequence data. Microb. Genom. 2018; 4(7): e000186. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000186

7. Kapatai G., Sheppard C.L., Al-Shahib A., Litt D.J., Underwood A.P., Harrison T.G., et al. Whole genome sequencing of Streptococcus pneumoniae: development, evaluation and verification of targets for serogroup and serotype prediction using an automated pipeline. PeerJ. 2016; 4: e2477. https://doi.org/10.7717/peerj.2477

8. Enright M.C., Spratt B.G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology. 1998; 144(11): 3049-60. https://doi.org/10.1099/00221287-144-11-3049

9. Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 2018; 3: 124. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1

10. Gladstone R.A., Lo S.W., Lees J.A., Croucher N.J., van Tonder A.J., Corander J., et al. International genomic definition of pneumococcal lineages, to contextualise disease, antibiotic resistance and vaccine impact. EBioMedicine. 2019; 43: 338-46. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.04.021

11. Ganaie F., Saad J.S., McGee L., van Tonder A.J., Bentley S.D., Lo S.W., et al. A new pneumococcal capsule type, 10D, is the 100th serotype and has a large cps fragment from an oral streptococcus. mBio. 2020; 11(3): e00937-20. https://doi.org/10.1128/mBio.00937-20

12. Матосова С.В., Миронов К.О., Шипулина О.Ю., Нагибина М.В., Рыжов Г.Э., Венгеров Ю.Я. Характеристика серотипов Streptoccus pneumoniae, вызвавших гнойный бактериальный менингит на территории Москвы в период с 2016 по 2019 г. В кн.: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика и биобезопасность - 2020». М.; 2020.

13. Hunter P.R., Gaston M A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26(11): 2465-6. https://doi.org/10.1128/jcm.26.11.2465-2466.1988


Об авторах

К. О. Миронов
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Миронов Константин Олегович — доктор медицинских наук, руководитель научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов ЦНИИ Эпидемиологии.
Москва.



И. И. Гапонова
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Гапонова Ирина Игоревна — лаборант-исследователь научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов ЦНИИ Эпидемиологии.
Москва.



В. И. Корчагин
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Корчагин Виталий Иванович — кандидат биологических наук, научный сотрудник научной группы разработки новых методов выявления генетических полиморфизмов ЦНИИ Эпидемиологии.
Москва.



Ю. В. Михайлова
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Михайлова Юлия Владимировна — кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов антибиотикорезистентности ЦНИИ Эпидемиологии.
Москва.



А. А. Шеленков
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Шеленков Андрей Александрович — кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов антибиотикорезистентности ЦНИИ Эпидемиологии.
Москва.



В. В. Каптелова
Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора
Россия

Каптелова Валерия Владимировна — младший научный сотрудник научной группы геномики и постгеномных технологий ЦНИИ эпидемиологии.

Москва.



А. Н. Чагарян
НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета
Россия

Чагарян Аида Нуримановна — кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики НИИ антимикробной химиотерапии СГМУ.
Смоленск.



Н. В. Иванчик
НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета
Россия

Иванчик Натали Владимировна — кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории антибиотико-резистентности НИИ антимикробной химиотерапии СГМУ.
Смоленск.



Р. С. Козлов
НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета
Россия

Козлов Роман Сергеевич — доктор медицинских наук, профессор, директор НИИ антимикробной химиотерапии СГМУ.
Смоленск.



Просмотров: 176


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)