Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Оценка способности холерных вибрионов формировать биоплёнку на поверхности хитинового панциря речного рака

https://doi.org/10.36233/0372-9311-99

Полный текст:

Аннотация

Введение. Большинство бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток; а в виде прикреплённых к субстрату биоплёнок. Одним из наиболее экологически важных субстратов является хитин. Vibrio cholerae; как и большинство представителей семейства Vibrionaceae; обладают хитинолитическим комплексом и могут разлагать хитин. Способность V. cholerae образовывать биоплёнку на хитиновых субстратах может объяснить механизм формирования экологической ниши для сохранения и переноса возбудителя в новые регионы с вероятностью формирования новых очагов холеры.

Цель работы — методом ПЦР в режиме реального времени определить способность V. cholerae формировать биоплёнку на хитиновом панцире речного рака (Astacus astacus).

Материалы и методы. Проведён сравнительный анализ сроков образования биоплёнки V. cholerae различных серогрупп и токсигенности.

Результаты. Установлено; что V. cholerae независимо от серогруппы и токсигенности способны образовывать биоплёнку; однако токсигенные штаммы tсpA+ обладают большей интенсивностью биоплёнкообразования; чем нетоксигенные; у которых ген tсpA отсутствует.

Введение

В результате накопленных к настоящему времени экспериментальных данных некоторые исследователи стали рассматривать планктонную форму как способ перемещения микробной клетки от одной поверхности к другой, т.е. как кратковременное состояние в жизни бактерий [1]. В настоящее время известно, что большинство бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а в виде прикреплённых к субстрату биопленок [1]. Формирование биоплёнки — одна из стратегий выживания Vibrio cholerae, которая ассоциируется с повышенной стрессоустойчивостью, расширением доступа к питательным веществам и использованием её в качестве средства для распространения, когда возбудитель холеры прикрепляется к живым мобильным хозяевам [2].

M. Sultana и соавт. (2018), проводя исследования поверхностных водоёмов, пришли к выводу, что биоплёнки являются средством персистенции и неотъемлемой частью годового жизненного цикла V. cholerae в Бангладеш. При мониторинге поверхностных водоёмов в течение года авторы установили, что в весенне-летний период V. cholerae находятся в планктонной форме, и это совпадает с ежегодными сезонными вспышками холеры в этом регионе [3]. По данным F. Yildiz (2009), D. Srivastava (2012), переход от свободного плавания к прикреплённому образу жизни [4][5] усиливает природную компетентность и горизонтальный перенос генов [6], а также обеспечивает повышенную защиту от хищников [7].

Особую роль в сохранении V. cholerae в водных экосистемах играют хитиновые покрытия членистоногих, некоторых диатомовых водорослей и грибов, на поверхности которых вибрион способен существовать в виде биоплёнки. Хитин — один из наиболее распространённых в природе полисахаридов. Эволюционно хитин для вибрионов служит основным питательным субстратом, а сформированные на его поверхности биоплёнки служат местом их обитания и убежищем от неблагоприятных факторов окружающей среды. Известно, что для человека биоплёнки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязнённой планктоном воды или термически необработанных морепродуктов [8–12]. Несмотря на то что в последние десятилетия получены обширные экспериментальные знания о биоплёнках V. cholerae, до сих пор нет простых и доступных методов для оценки способности формирования V. cholerae на поверхности хитина.

Цель работы — оценка способности V. cholerae формировать биоплёнку на поверхности хитинового панциря речного рака (по показателю биоплёнкообразования — ПБ) методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Материалы и методы

Для определения способности V. cholerae формировать биоплёнку был разработан метод с использованием хитина широкопалого речного рака Astacus astacus в качестве биотического субстрата1.

Фрагменты хитинового панциря речного рака размером 0,5 × 0,5 см и массой 100 мг помещали во флаконы (100 мл) с 30 мл речной воды и автоклавировали при 132о С 30 мин. Штаммы V. cholerae El Tor ctxА+tcpА+ № Р-19613 (Инаба), № 5879 (Инаба), № 18332 (Огава), № 19241 (Инаба); ctxАtcpА № 19754 (Инаба), № 20000 (Огава), № 17817 (Инаба); V. cholerae classical ctxА+tcpА+ № 434 (Огава) и V. cholerae nonO1/nonO139 ctxАtcpА № 30, выделенные в разные годы от людей и из воды поверхностных водоёмов, добавляли в среду культивирования до конечной концентрации 10микробных клеток (МК) на 1 мл. Работу проводили в соответствии с требованиями биологической безопасности2. Исследуемые штаммы V. cholerae культивировали при 15 ± 2ºС, что соответствует весеннеосенней температуре в поверхностных водоёмах в Ростове-на-Дону.

Для постановки ПЦР фрагменты хитина извлекали пинцетом, трижды промывали в физиологическом растворе, несвязавшиеся клетки удаляли на листе фильтровальной бумаге и вносили в стандартные пробирки (Эппендорф) ёмкостью 1,5 мл с 1 мл физиологического раствора. Лизис клеток, включая образцы биоплёнок, проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-093. Полученные препараты использовали для постановки ПЦР-РВ. С целью определения количества клеток вибрионов при проведении ПЦР-РВ были использованы образцы с известным количеством искомой ДНК — стандарты, в качестве которых использовали разведения взвесей суточных культур V. cholerae с известной концентрацией клеток, которую определяли путём высева на агаровые пластины и последующего подсчёта КОЕ. Количество клеток в исследуемых препаратах рассчитывали автоматически с помощью программного обеспечения амплификатора «DTlite 5S1» (ДНК-технология). В качестве мишени амплификации использовали ген hlyA [13][14]. ПБ рассчитывали как отношение количества МК V. cholerae на фрагменте хитинового панциря к их количеству в среде инкубации над хитиновыми пластинами.

Для визуализации экзополисахарида (основного компонента матрикса биоплёнки) и клеток V. cholerae фрагменты хитинового панциря с биоплёнкой отпечатывали на предметном стекле с помощью пинцета, после чего фрагменты хитина погружали в дезинфицирующий раствор, а покровное стекло с мазком-отпечатком фиксировали в 96о спирте в течение 20 мин. Препараты окрашивали конго красным и фуксином (оба «Интерхим»). В качестве контроля использовали планктонную форму штаммов. Исследуемые образцы изучали в световом микроскопе «Zeiss Axiostarplus» («Carl Zeiss Microscopy»).

Наличие/отсутствие роста исследуемых штаммов параллельно подтверждали бактериологическим методом, отпечатывая фрагменты хитинового панциря с биоплёнкой на агаровых пластинах (агар Мартена, рН 7,4 ± 0,2).

Результаты

В ходе исследования установили, что у большинства токсигенных штаммов V. cholerae, выделенных от человека, начало образования биоплёнки происходило со 2-х суток от начала эксперимента. ПБ этих штаммов на 2-е сутки составлял 1,0–1,7. На 6–7-е сутки от начала эксперимента количество МК на хитиновом панцире превышало их количество в планктоне (2,4–8,1). Исключение составили штаммы V. cholerae El Tor № 5879 ctxА+tcpА+, V. cholerae classical № 434 ctxА+tcpА+, у которых максимальное количество МК на хитиновом субстрате отмечали на 35-е сутки от начала эксперимента (3,0 и 7,5 соответственно). Интересно, что эти штаммы относятся к разным сероварам (Инаба и Огава). У штаммов ctxА+tcpА+ водного происхождения на 2-е сутки от начала эксперимента этот показатель был ниже — 0,5–0,8. К 7-м суткам инкубации ПБ токсигенных штаммов, выделенных из воды, значительно превышал этот показатель штаммов ctxА+, выделенных от человека (3,5–8,1).

У штаммов V. cholerae El Tor ctxАtcpА и V. cholerae nonO1/nonO139 водного происхождения количество МК на хитиновом панцире превышало количество МК в субстрате также на 6–7-е сутки, однако ПБ были значительно ниже, чем у токсигенных штаммов (0,1–1,7). Возможно, данный процесс у этих штаммов остановился на стадии обратимой адгезии. В течение срока наблюдения ПБ изменялся (уменьшался или увеличивался; таблица), следовательно, биоплёнкообразование — это динамичный процесс.

ПБ V. cholerae на хитиновом панцире речного рака
Biofilm formation index of V. cholerae on the chitinous carapace of crayfish

При визуализации мазков-отпечатков к 7-м суткам у токсигенных штаммов на всех микропрепаратах отмечали крупное скопление клеток V. cholerae, окружённых аморфным веществом (экзополисахаридом), окрашенным в ярко-розовый цвет, без чёткой формы, т.к., наслаиваясь друг на друга, они образовывали разного размера конгломераты (рис. 1, а).

Нетоксигенные V. cholerae образовывали скопления разных размеров, окружённые аморфным веществом розового цвета по всему полю зрения, однако размеры скоплений клеток и окраска экзополисахарида были менее интенсивными, чем у токсигенных штаммов (рис. 1, б). В контрольных пробах (планктонная форма) в микропрепаратах наблюдали единичные клетки V. cholerae (рис. 2).

Рис. 1. Биоплёнка V. cholerae на хитиновом фрагменте, ×1600.
а — V. cholerae № 19613 ctxА+tcpА+; б — V. cholerae № 20000 ctxАtcpА.
Fig. 1. V. cholerae biofilm on a chitinous fragment, ×1600.
а — V. cholerae No. 19613 ctxA+tcpA+; b — V. cholerae No. 20000 ctxAtcpA.

Рис. 2. Планктонная форма V. cholerae, ×1600.
а — V. cholerae № 19613 ctxА+tcpА+; б — V. cholerae № 20000 ctxАtcpА.
Fig. 2. Planktonic form of V. cholerae, ×1600.
а — V. cholerae No. 19613 ctxA+tcpA+; b — V. cholerae No. 20000 ctxAtcpA.

Ранее нами было проведено электронно-микроскопическое исследование образцов биоплёнок V. cholerae O1 El Tor Inaba штамм № Р-19613 ctxA+tcpA+ и V. cholerae O1 El Tor Ogava штамм № Р-20000 ctxAtcpA. Сравнительный анализ электронограмм показал, что образование биоплёнки на поверхности хитина у V. cholerae происходит независимо от наличия генов токсин-корегулируемых пилей адгезии tcpA и холерного токсина ctxA, однако интенсивность биоплёнкообразования у данных штаммов различна [15].

Обсуждение

Исходя из полученных данных, токсигенный штамм V. cholerae О1 ctxA+tcpA+ обладает большей интенсивностью биоплёнкообразования, чем штаммы V. cholerae О1 ctxAtcpA. На это указывают большая толщина биопленки, объём, плотность матрикса и активность их метаболических процессов.

Такая разница в структурных образованиях биоплёнок между токсигенными и нетоксигенными штаммами, выявленная при изучении в световом микроскопе и методом трансмиссионной электронной микроскопии, свидетельствует о том, что их образование зависит в значительной степени от наличия tcpА в геноме штаммов V. cholerae, взятых в эксперимент. Это согласуется с выводами ряда авторов о большей биоплёнкообразующей способности штаммов tcpА+, что указывает на эпидемическую опасность биоплёнкообразования [15–19].

Заключение

Таким образом, представленные результаты подтверждают возможность использования методических приёмов, предлагаемых в работе, для оценки способности V. cholerae формировать биоплёнку на биотических субстратах. Способность токсигенных штаммов V. cholerae колонизировать поверхность хитиновых субстратов может привести к накоплению возбудителя в поверхностных водоёмах в случае завоза с эндемичных по холере территорий. Полученные результаты могут быть использованы как в фундаментальных научных исследованиях, так и в практических целях для дополнительной оценки патогенетического и персистентного потенциала штаммов V. cholerae.

1. Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Меньшикова Е.А., Курбатова Е.М., Титова С.В. Способ моделирования биопленок формируемых Vibrio cholerae О1 серогруппы на поверхности хитина. Патент РФ № 2685878; 2019.

2. СП 1.3.3118-13. Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности). М.; 2014.

3. МУ 1.3.2569-09. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности. М.; 2010.

Список литературы

1. Чернявский В.И. Бактериальные биопленки и инфекции (лекция). Аннали Мечниковського Інституту. 2013; (1): 86–90. Available at: http://www.imiamn.org.ua/journal/1_2013/PDF/18.pdf

2. Hall-Stoodley L.; Costerton J.W.; Stoodley P.; Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2): 95–108. https://doi.org/10.1038/nrmicro821

3. Sultana М.; Nusrin S.N.; Hasan A.; Sadique A.; Ahmed K.; Islam A.; et al. Biofilms comprise a component of the annual cycle of Vibrio cholera in the Bay of Bengal estuary. mBio. 2018; 9(2): e00483-18. https://doi.org/10.1128/mbio.00483-18

4. Yildiz F.H.; Visick K.L. Vibrio biofilms: so much the same yet so different. Trends Microbiol. 2009; 17(3): 109–18. https://doi.org/10.1016/j.tim.2008.12.004

5. Srivastava D.; Waters C.M. A tangled web: regulatory connections between quorum sensing and cyclic di-GMP. J. Bacteriol. 2012; 194(17): 4485–93. https://doi.org/10.1128/jb.00379-12

6. Lo Scrudato M.; Blokesch M. The regulatory network of natural competence and transformation of Vibrio cholerae. PLoS Genet. 2012; 8(6): e1002778. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002778

7. Matz C.; Kjelleberg S. Off the hook — how bacteria survive protozoan grazing. Trends Microbiol. 2005; 13: 302–7. https://doi.org/10.1016/j.tim.2005.05.009

8. Куликалова Е.С.; Урбанович Л.Я.; Саппо С.Г.; Миронова Л.В.; Марков Е.Ю.; Мальник В.В. и др. Биопленка холерного вибриона: получение; характеристика и роль в резервации возбудителя в водной окружающей среде. Журнал микробиологии; эпидемиологии и иммунобиологии. 2015; 92(1): 3–11.

9. Meibom K.L.; Li X.B.; Nielsen A.T.; Wu C.Y.; Rosemanand S.; Schoolnik G.K. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101(8): 2524–9. https://doi.org/10.1073/pnas.0308707101

10. Hunt D.E.; Gevers D.; Vahora N.M.; Polz M.F. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(1): 44–51. https://doi.org/10.1128/aem.01412-07

11. Rinaudo M. Chitin and chitosan: properties and applications. Prog. Polym. 2006; 31(7): 603–32. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2006.06.001

12. Lutz C.; Erken M.; Noorian P.; Sun S.; McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio. Front. Microbiol. 2013; 4: 375. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00375

13. Silva A.J.; Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and сholera pathogenesis. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(2): e0004330. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004330

14. Lyon W.J. TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1; O139; non-O1; and non-O139 in pure cultures; raw oysters; and synthetic seawater. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(10): 4685–93. https://doi.org/10.1128/aem.67.10.4685-4693.2001

15. Симонова И.Р.; Головин С.Н.; Титова С.В.; Половцева В.С.; Меньшикова Е.А.; Курбатова Е.М. Трансмиссионная электронная микроскопия биоплёнок vibriocholerae на хитине. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник статей проблемной комиссии (48.04) Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. Ростов-на-Дону; 2018: 69–73.

16. Shahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates: Diss. 2005. Available at: https://scholarworks.sjsu.edu/etd_theses/2839

17. Sun S.; Tay Q.X.M.; Kjelleberg S.; Rice S.A.; McDougald D. Quorum sensing-regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. ISME J. 2015; 9(8): 1812–20. https://doi.org/10.1038/ismej.2014.265

18. Nahar S.; Sultana M.; Naser M.N.; Nair G.B.; Watanabe H.; Ohnishi M.; et al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Front. Microbiol. 2011; 2: 260. https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260

19. Pruzzo C.; Vezzulli L.; Colwell R.R. Global impact of Vibrio cholerae interactions with chitin. Environ. Microbiol. 2008; 10(6): 1400–10. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2007.01559.x


Об авторах

Е. А. Меньшикова
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Меньшикова Елена Аркадьевна — кандидат биологических наук; старший научный сотрудник лаб. экологии холерных вибрионов.

Ростов-на-Дону



Е. М. Курбатова
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Курбатова Екатерина Михайловна — научный сотрудник лаб. экологии холерных вибрионов.

Ростов-на-Дону



С. О. Водопьянов
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Водопьянов Сергей Олегович — доктор медицинских наук; главный научный сотрудник; исполняющий обязанности заведующего лаб. биохимии микробов.

Ростов-на-Дону



Р. В. Писанов
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Писанов Руслан Вячеславович — кандидат биологических наук; ведущий научный сотрудник; исполняющий обязанности заведующего лаб. диагностики особо опасных инфекций.

Ростов-на-Дону



С. В. Титова
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Титова Светлана Викторовна — доктор медицинских наук; ведущий научный сотрудник лаб. Экологии холерных вибрионов.

Ростов-на-Дону



Просмотров: 69


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)