Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Микробный синтез и оценка бактерицидных свойств наночастиц сульфида кадмия

https://doi.org/10.36233/0372-9311-89

Полный текст:

Аннотация

Введение. Продуктивность микробного синтеза стабильных наночастиц определяется стадией роста популяций бактериальных культур, используемых для получения наноструктур. Перспективно изучение биоцидной активности биогенных наночастиц сульфида кадмия (NPsCdS), сравнимых по свойствам с наноматериалами, полученными физико-химическими методами.

Цель работы — оценить влияние фазы роста клеток штаммов бактерий Bacillus subtilis 168 и Shewanella oneidensis MR-1 на эффективность биосинтеза NPsCdS и изучить их бактерицидные свойства в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных штаммов микроорганизмов.

Материалы и методы. Наночастицы получали введением солей Na2S и CdCl2 до конечной концентрации 2 мМ : 2 мМ в культуральные жидкости бактерий с клетками, находящимися в различных фазах роста. Эффективность биосинтеза NPsCdS оценивали по оптической плотности водных растворов наночастиц. Бактерицидные свойства NPsCdS определяли по диаметру зоны ингибирования роста грамположительных бактерий B. subtilis 168, B. amyloliquefaciens, Streptococcus salivarius, Rhodococcus rhodochrous и грамотрицательных S. oneidensis MR-1, Escherichia coli K-12, Pseudomonas putida.

Результаты. Установлено, что использование клеток в стационарной фазе роста (18–24 ч) способствует получению максимального количества NPsCdS, соответствующего концентрациям 1,0–1,2 мг/мл. Высокая антимикробная активность NPsCdS показана в отношении грамположительных микроорганизмов, среди грамотрицательных бактерий незначительную чувствительность проявил штамм P. putida.

Обсуждение. Результаты экспериментов расширяют научные данные о влиянии фазы ростового цикла бактерий для получения наночастиц. В отношении NPsCdS оптимальной является стационарная фаза роста B. subtilis 168, S. oneidensis MR-1. Впервые продемонстрирована цитотоксичность NPsCdS/Shewanella в отношении бактерий различных таксономических групп.

Заключение. Разработан эффективный метод получения внеклеточных NPsCdS с использованием бактерий B. subtilis 168, S. oneidensis MR-1 в стационарной фазе роста. Показана биоцидная активность биогенных NPsCdS, что позволяет рассматривать их как новый класс противомикробных агентов.

Введение

В последние годы возрос интерес к синтезу флюоресцентных квантовых точек (КТ) полупроводниковых халькогенидов металлов, благодаря их уникальным оптическим, каталитическим и антибактериальным свойствам, обусловленным размером и морфологией [1]. Среди такого типа наноматериалов наиболее значимыми являются наночастицы сульфида кадмия (NPsCdS), обладающие широким спектром поглощения и узкой полосой излучения, длительным временем жизни флюоресценции, высокими показателями фотостабильности и квантового выхода [2]. Перечисленные характеристики способствуют применению КТ NPsCdS в производстве оптоэлектронных устройств [3] и фотокатализаторов [4]. Благодаря способности контролировать рост штаммов микроорганизмов, наночастицы металлов и их солей, в том числе NPsCdS, демонстрируют бактерицидную активность против грамположительных (ГП) и грамотрицательных (ГО) бактерий, что делает их перспективными для использования в биомедицине в качестве антибактериальных агентов нового поколения [5][6].

Для промышленного применения нанокристаллов халькогенидов металлов необходимы коммерчески выгодные и экологически безопасные способы их производства. На сегодняшний день разработаны различные химические и физические методы синтеза NPsCdS, позволяющие контролировать размер и морфологию наноструктур, однако эти промышленные способы имеют, как правило, высокую стоимость, энергетически затратны, требуют использования органических растворителей с образованием избытка токсичных отходов [2].

Биотехнологический подход, основанный на применении природных компонентов — микроорганизмов, водорослей, грибов, дрожжей и растительных экстрактов — в качестве биокатализаторов биосинтеза наночастиц, может служить дополнением и альтернативой промышленному синтезу наночастиц определённого состава [7–9]. Этот метод экономически выгоден, не требует сложной аппаратуры и больших трудозатрат, экологически безопасен. Биосинтез биогенных наночастиц происходит в жидких средах, содержащих соответствующие ионы химических соединений, при оптимальных температурах для биокомпонентов [8]. Различные виды бактерий являются эффективными системами для производства широкого спектра наноструктур, в том числе халькогенидов металлов [8][9], что позволяет рассматривать микробный синтез наночастиц как новый инструмент «зеленой» химии [9]. Установлено, что локализация процесса биосинтеза наночастиц может быть как внеклеточной, так и внутриклеточной [8], что продемонстрировано в работах [9–11] с использованием других бактериальных штаммов и указывает на разнообразие процессов образования бинарных наночастиц халькогенидов металлов. При этом в большинстве случаев микробный синтез NPsCdS имеет внутриклеточную локализацию, тогда как с практической точки зрения для выделения наночастиц внеклеточный синтез более экономически эффективен и методологически удобен [12]. Поэтому очень важно разрабатывать способы биосинтеза внеклеточных NPsCdS [13].

Многочисленные исследования убедительно доказали, что биомолекулы белков, аминокислот, полисахаридов, секретируемые бактериями, отвечают за образование наноструктур, стабилизацию в водной среде, определяют их размеры и характеристики [7][8]. Наличие природных биополимеров на поверхности КТ повышает биосовместимость нанокристаллов, что является перспективным для медицинских приложений и выгодно отличает биотехнологический подход от промышленных способов получения наноматериалов [8]. По своим свойствам наночастицы биогенного происхождения сравнимы с нанокристаллами, полученными промышленным способом [9][14].

Биосинтез наночастиц халькогенидов металлов и их характеристики, такие как форма, размер, тип кристаллической структуры [7], устойчивость к агломерации и заряд поверхности [15], величина запрещенной зоны [16], интенсивность флюоресценции [17], зависят от применяемых видов бактерий и секретируемых ими биомолекул [9]. Условия проведения биосинтеза — время инкубации реакционной смеси [10], концентрация солей металлов [8], температура и показатель рН [12] — влияют на эффективность биосинтеза наноматериалов. Значительную роль в оптимизации процессов получения коллоидных дисперсий биогенных наночастиц играет фаза роста клеток микроорганизмов, применяемых при биосинтезе, что связано с образованием на различных стадиях роста бактерий определённых белков и других биополимерных молекул, адсорбирующихся на поверхности наноструктур и стабилизирующих их в водных суспензиях [9][12][16][18].

В связи с вышеизложенным целью данного исследования была оценка влияния фазы роста клеток бактериальных штаммов Bacillus subtilis 168 и Shewanella oneidensis MR-1 на эффективность биосинтеза NPsCdS, а также изучение бактерицидных свойств биогенных NPsCdS в отношении штаммов различных таксономических групп.

Материалы и методы

Штаммы микроорганизмов, использованные для проведения биосинтеза наночастиц NPsCdS и оценки их бактерицидных свойств, были получены из Национального биоресурсного центра — Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика.

Среды. Культивирование бактериальных клеток осуществляли на полноценных питательных средах Luria–Bertani в жидкой (LB) и агаризованной (LBА) формах, приготовленных по стандартной прописи [19]. Использовали компоненты питательных сред: агар («Sigma-Aldrich»), триптон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый («Диаэм» и «Химмед»). Также в работе применяли соли сульфида натрия — Na2S×9H2O (ч.д.а) и хлорида кадмия — CdCl2×2,5H2O (ч.д.а) («Химмед», «Диаэм»).

Определение фаз роста бактерий B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1. Штаммы культивировали в 6 мл LB-среды при 30°С в условиях аэрации на круговой качалке при 220 об/мин в течение 18 ч для получения суспензии клеток «ночных» культур. Суспензию клеток «ночной» культуры в объеме 1 мл переносили в колбу, содержащую 100 мл стерильной LB-среды, и определяли оптическую плотность на фотоэлектрическом колориметре «КФК-2МП» («ЗОМЗ») при длине волны 590 нм (ОП590). Штаммы культивировали при тех же условиях в течение 48 ч, отбирая пробы в объеме 2 мл каждые 2–4 ч с последующим измерением ОП590, используя в качестве контрольной пробы исходную LB-среду. Построение кривых роста заявленных бактерий выполняли с помощью программы «MS Excel».

Оценка эффективности биосинтеза NPsCdS в зависимости от фазы роста бактерий. Биосинтез NPsCdS проводили с использованием бактериальных культур, находящихся на разных фазах роста. Продолжительность культивирования штаммов на среде LB — 6 ч (начало логарифмической фазы), 8 ч (логарифмическая фаза), 18 и 24 ч (стационарная фаза), 48 ч (фаза отмирания). Эффективность биосинтеза NPsCdS в зависимости от фазы роста бактерии оценивали по ОП590 образцов водных растворов наночастиц, полученных по методике бактериального синтеза. В качестве контроля использовали деионизированную воду, измерения проводили трехкратно. Результаты обрабатывали посредством статистических инструментов «MS Excel» для малой выборки. Концентрацию биогенных NPsCdS вычисляли весовым методом [20].

Микробный синтез NPsCdS. Колбы, содержащие по 100 мл LB-среды, засевали ночными культурами бактерий B. subtilis 168 или S. oneidensis MR-1, выращенных при 30ºС на среде LB, либо суточной культурой бактерий со среды LBА на чашках Петри. Штаммы культивировали при 30ºС на круговой качалке (220 об/мин) в течение 6, 8, 18, 24 и 48 ч. В колбы, содержащие культуральную жидкость (КЖ) с клетками бактерий на разных фазах роста, вносили водные растворы солей Na2S×9H2O и CdCl2×2,5H2O до конечных концентраций 2 мМ : 2 мМ. Вес сухих навесок солей рассчитывали на общий объем КЖ. Инкубацию реакционной смеси клеток B. subtilis 168 (или S. oneidensis MR-1) и солей осуществляли в течение 24 ч при 30ºС и постоянном перемешивании при 220 об/мин. Затем клетки осаждали центрифугированием («MSE») при 8000 об/мин в течение 30 мин и удаляли. Надосадок, содержащий биогенные наночастицы, декантировали и фильтровали через мембранный фильтр «Nuclepore» с размером пор 0,2 мкм («Whatman»). Выделение и очистку NPsCdS из фильтратов осуществляли в стерильной деионизированной воде двукратным центрифугированием («Beckman Coulter») в режиме повышенной скорости 32 000 об/мин — 1 ч. Суспензии диспергированных в деионизированной воде наночастиц хранили при 4ºС в микропробирках типа Эппендорф по 1 мл.

Для контрольного эксперимента использовали среду LB того же объема, не содержащую бактериальных клеток, в которую добавляли водные растворы солей Na2S×9H2O и CdCl2×2,5H2O до конечной концентрации 2 мМ : 2 мМ. Последующие этапы биосинтеза остались без изменения.

Электронная микроскопия. Форму и размер наночастиц NPsCdS, полученных микробным синтезом, а также осадок в контрольном эксперименте анализировали на просвечивающем электронном микроскопе «JEM-2100» («JEOL») с ускоряющим напряжением 200 кэВ в режиме светлопольных изображений [21].

Оценка бактерицидных свойств биогенных NPsCdS. Биоцидные свойства NPsCdS оценивали методом двуслойной диффузии в агаре (LBA) на чашках Петри (диаметр 90 мм) в соответствии с ОФС.1.2.4.0010.181. В качестве тест-культур использовали ГО-штаммы (Shewanella oneidensis MR-1 № В-9861, Escherichia coli K-12 № В-3345, Pseudomonas putida № В-4492) и ГП-штаммы микроорганизмов (Bacillus subtilis 168 № В-7360, Bacillus amyloliquefaciens № В-11265, Streptococcus salivarius № В-5994, Rhodococcus rhodochrous № B-3043). Антимикробную активность наночастиц контролировали по величине диаметра зоны ингибирования роста тест-штаммов (в мм) в лунках, сделанных в толще агара металлическим штамп-пробойником. В лунки вносили 50 мкл суспензии NPsCdS в концентрации 1 мг/мл, т.е. в лунке содержалось 0,05 мг наночастиц. Время инкубации чашек Петри с тест-микроорганизмами и биогенными NPsCdS составляло 24–48 ч при температурах, оптимальных для жизнедеятельности бактерий. В контрольном эксперименте вместо суспензии наночастиц использовали стерильную деионизированную воду (по 50 мкл на лунку). Эксперименты повторяли трехкратно.

Результаты

Роль бактерий в биосинтезе наночастиц

Роль бактериальных клеток как биологической субстанции в образовании индивидуальных, устойчивых к агломерации наночастиц продемонстрирована в экспериментах по биосинтезу наночастиц в присутствии бактерий. В результате реакции Na2S и CdClв жидкой среде образуются NaCl и нерастворимый в воде CdS. При наличии в реакционной среде бактериальных клеток и секретируемых ими белков последние адсорбируются на поверхности частиц CdS, обволакивая их и создавая защитный слой, стабилизирующий наночастицы в водной среде, что предотвращает их агломерацию и седиментацию. В контрольном эксперименте, в результате смешения двух солей, но без участия бактерий, образуется нерастворимый осадок, состоящий из агломерированных частиц CdS. На рис. 1 представлены фотографии колб со средой LB, в которые были добавлены соли Na2S и CdClв отсутствие клеток микроорганизмов (рис. 1, а), и содержащие клетки штамма S. oneidensis MR-1 в стационарной фазе роста (рис. 1, в). В первом случае реакционный раствор был практически прозрачным, имел насыщенный жёлтый цвет и плотный оранжевый осадок CdS на дне колбы (рис. 1, а), во втором — КЖ в колбе имела желтоватый оттенок, мутность была обусловлена наличием бактериальных клеток и наночастиц в диспергированном состоянии, осадок на дне отсутствовал (рис. 1, в).

Полученные суспензии частиц представлены на электронных микрофотографиях. На рис. 1, б видно, что частицы, полученные без использования бактериальных клеток, значительно агломерированы и сгруппированы. На микрофотографии образца, синтезированного в КЖ S. oneidensis MR-1, различимы расположенные отдельно друг от друга наноразмерные частицы, имеющие кристаллическую природу, без крупных агломератов (рис. 1, г). Таким образом, сравнительный анализ образцов водных суспензий частиц CdS, полученных двумя принципиально различными способами, подтверждает обязательное участие биокомпонентов, в частности микроорганизмов, в синтезе стабильных в водном растворе биогенных наноструктур.

Рис. 1. Синтез CdS в отсутствие и при наличии бактериальных клеток.
а — фрагмент колбы, содержащей соли Na2S, CdCl2 в LB-среде (контроль); б — электронная микрофотография суспензии частиц, синтезированных в колбе а; в — фрагмент колбы, содержащей соли Na2S, CdCl2 в КЖ S. oneidensis MR-1; г — микрофотография суспензии NPsCdS из колбы в.
Fig. 1. Synthesis of CdS in the absence or presence of bacterial cells.
а — fragment of a flask containing Na2S, CdCl2 salts in LB-medium (control); b — electron micrograph of a suspension of particles synthesized in the flask а; c — fragment of a flask containing Na2S, CdCl2 salts in culture liquid of S. oneidensis MR-1; d — micrograph of a suspension of NPsCdS from the flask c.

Фазы роста бактерий B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1, используемых для биосинтеза NPsCdS

Динамика роста бактериальных популяций штаммов B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1 как периодических культур, выращиваемых на жидкой питательной среде в одинаковых условиях, представлена в виде кривых роста исследуемых микроорганизмов (рис. 2).

Рис. 2. Динамика бактериального роста B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1 на жидкой LB-среде при 30ºС.
I — лаг-фаза; II — экспоненциальная (лог-фаза); III — стационарная фаза; IV — фаза отмирания.
Fig. 2. Dynamics of bacterial growth for B. subtilis 168 and S. oneidensis MR-1 in liquid LB-medium at 30ºС.
I — lag-phase; II — exponential (log-phase); III — stationary phase; IV — phase of cell death.

Установлено, что оба вида бактерий демонстрируют классический «сценарий» роста и развития бактериальных популяций при данных условиях культивирования. Так, на рис. 2 отчетливо видна сменяемость фаз роста для обеих культур: I — начальная (лаг-фаза), длящаяся около 2 ч; II — экспоненциальная или логарифмическая (лог-фаза), составляющая примерно 8 ч; далее, начиная с 8 ч, наступает стационарная фаза (III), продолжающаяся до 24–26 ч. По завершении этого времени бактериальные популяции обоих штаммов показывают снижение ОП — микроорганизмы достигают поздней стационарной фазы или фазы отмирания (IV), протекающей вплоть до окончания процесса культивирования. В интервале от лог-фазы и до 48 ч наблюдается незначительное расхождение кривых по величине ОП590 — КЖ B. subtilis 168 характеризуется большими значениями, чем популяция бактериальных клеток S. oneidensis MR-1. Таким образом, культуры B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1 демонстрируют схожесть ростовых процессов популяций бактериальных клеток.

Эффективность биосинтеза NPsCdS в зависимости от фазы роста бактерий

Определение эффективности биосинтеза NPsCdS в зависимости от фазы роста бактерий было проведено с использованием обоих штаммов. Наночастицы мы обозначили как NPsCdS/Bacillus и NPsCdS/Shewanella. Результаты измерений ОП590 водных растворов NPsCdS/Bacillus и NPsCdS/Shewanella, проведенных в соответствии с продолжительностью культивирования клеток штаммов, приведены на рис. 3. Из гистограммы следует, что вероятность получения большего количества биогенных наночастиц возрастает при использовании бактерий, выращенных в интервале 18–24 ч, т.е. на стационарной стадии культивирования клеток в питательной среде. При этом максимальное значение ОП590 коллоидного раствора наночастиц было достигнуто при использовании 24-часовой культуры, что позволяет говорить о стационарной фазе ростового цикла как об оптимальной для биосинтеза нанокристаллов. Полученное значение ОП590 NPsCdS/Bacillus соответствовало 1,2 ± 0,1 мг/мл, а NPsCdS/Shewanella — 1,0 ± 0,1 мг/мл концентрации биогенных наночастиц в водном растворе.

Рис. 3. Зависимость эффективности биосинтеза NPsCdS от времени культивирования бактерий B. subtilis 168 и S. oneidensis MR-1.
Fig. 3. Dependence of the efficiency of biosynthesis of NPsCdS on the cultivation time of bacteria B. subtilis 168 and S. oneidensis MR-1.

Проведение реакции биосинтеза NPsCdS с использованием клеток штаммов в лог-фазе (6–8 ч) или на стадии отмирания (48 ч) приводит к значительному снижению ОП590 коллоидного раствора наночастиц и, как следствие, к снижению концентрации биогенных наночастиц в конечном водном растворе по сравнению с использованием 24-часовых культур.

Антимикробная активность биогенных NPsCdS

В соответствии с целями работы были определены биоцидные свойства наночастиц NPsCdS биогенного происхождения. Для лабораторных испытаний использовали водную суспензию NPsCdS/ Shewanella. Результаты сравнительного анализа зон подавления роста тест-культур (таблица) демонстрируют явное различие в чувствительности микроорганизмов к воздействию биогенных наночастиц. Из таблицы видно, что из 4 исследованных ГП-штаммов различных видов все представители оказались чувствительными к действию наночастиц, тогда как среди 3 ГО-штаммов только один демонстрировал чувствительность, выражающуюся небольшим диаметром зоны подавления роста штамма наночастицами. Таким образом, ГП-штаммы более чувствительны к NPsCdS по сравнению с бактериями, принадлежащими к ГО-группе. Среди ГП-штаммов также наблюдается различие по уровню чувствительности к биогенным наночастицам. Так, из 4 видов ГП-бактерий наиболее чувствительным оказался штамм B. subtilis 168. Бактерии B. amyloliquefaciens, S. salivarius и R. rhodochrous проявляли меньшую чувствительность к действию NPsCdS. ГО-бактерии S. oneidensis MR-1 и E. coli K-12 были устойчивы к NPsCdS. Наночастицы NPsCdS/Shewanella подавляли рост тест-культуры P. putida, однако при сравнении величины зоны ингибирования этого штамма с ГП-бактериями такой результат можно считать незначительным. В случае с контрольными образцами, содержащими стерильную деионизированную воду вместо наночастиц, подавления роста микроорганизмов не наблюдали (таблица).

Антимикробная активность NPsCdS/Shewanella в отношении тест-культур микроорганизмов различных таксономических групп (M ± m)
Antimicrobial activity of NPsCdS/Shewanella against test cultures of microorganisms of various taxonomic groups (M ± m)


Примечание. Эксперимент проведён в 3 независимых повторах.
Note. Experiment was carried out in 3 independent repetitions.

Обсуждение

В подтверждение основополагающей роли биомолекул бактериального происхождения в формировании и стабилизации биогенных наноструктур нами ранее был проведен ряд исследований по изучению условий микробного синтеза наночастиц сульфидов металлов, в частности NPsCdS, количественной и качественной оценке состава биослоя, адсорбированного на поверхности наночастиц, определению их параметров [13]. Так, при использовании разработанной нами оптимизированной методики биосинтеза наночастиц — путём введения реакционных солей-источников ионов серы и металла в КЖ бактерий — был подтверждён внеклеточный механизм синтеза наноструктур сульфидов серебра, кадмия и цинка на поверхности бактериальных клеток штаммов различных видов или в непосредственной близости с ними в зоне внеклеточной полимерной субстанции [20][21], что для практического получения биогенных наноструктур наиболее эффективно.

Установлено влияние бактерии на формирование определённого состава биослоя на поверхности NPsCdS и других наночастиц сульфидов металлов: для S. oneidensis MR-1 характерна адсорбция до 15 разнообразных белковых молекул внешней оболочки или цитоплазматической мембраны бактерии, тогда как для B. subtilis 168 — всего один вид белка — флагеллин [21]. Белок-покрытые наночастицы характеризовались устойчивостью к агломерации в водном растворе, связанной с величиной показателя дзета-потенциала (–22,4 мВ для NPsCdS/Shewanella и –20,5 мВ для NPsCdS/Bacillus) и гидродинамического диаметра (160 и 250 нм соответственно) [22]. По нашим данным, биогенные NPsCdS вне зависимости от штамма бактерии характеризуются как сферические нанокристаллы диаметром 5 ± 1 нм, флюоресцирующие в синей области спектра (300– 400 нм) при длине волны возбуждения 270 нм [22].

В настоящей работе гистограмма зависимости эффективности получения NPsCdS от времени культивирования B. subtilis и S. oneidensis (рис. 3) демонстрирует продуктивность стационарной фазы роста обеих бактерий, что соотносится с данными литературы. Действительно, в исследовании [18] инкубация смеси CdCl2 и Na2S с клетками E. coli, выращенными на стационарной фазе, привела к почти 20-кратному повышению продуктивности монодисперсных КТ NPsCdS (2–5 нм) по сравнению с граничащей поздней лог-фазой. Авторы объяснили это увеличением выхода большого количества восстановленных тиолов, доступных на протяжении стационарной стадии роста E. coli. В эксперименте [16] добавление CdCl2 к клеткам E. coli, находящимся ближе к концу лог-стадии, способствовало внеклеточному синтезу NPsCdS, тогда как введение соли на ранней стадии клеточного роста привело к внутриклеточному осаждению наночастиц, затрудняющему их извлечение и очистку.

В нашей работе продуктивность стационарной стадии роста B. subtilis и S. oneidensis доказана повышением выхода NPsCdS на 20–25% по сравнению с лог-фазой (8 ч) и на 45–50% по сравнению с 48-часовыми культурами (рис. 3). Данные соотносятся с ростовыми кривыми культур, также имеющими максимумы ОП590 КЖ в стационарной фазе (рис. 2). Видимо, это связано с наибольшей концентрацией клеток в данной фазе роста, а также с активной жизнедеятельностью бактерий в питательной среде, способных выделять молекулы белка и других метаболитов в количестве, необходимом для генерации наноструктур, их накопления и стабилизации. Снижение биосинтеза NPsCdS (ОП590) при использовании бактерий, культивированных в течение 6, 8 или 48 ч, можно интерпретировать недостаточным для образования наночастиц количеством секретируемых белков. Негативное влияние на эффективность синтеза NPsCdS может быть следствием разрушения клеток из-за сокращения питательных веществ, накопления продуктов жизнедеятельности или под воздействием ферментов в условиях длительного культивирования бактерий (48 ч).

Возможность регулирования процесса получения наночастиц, покрытых слоем стабилизатора природного происхождения, привлекательна для внедрения биогенных наноструктур в конкретные приложения биомедицины. Так, мощное антибактериальное и противораковое действие NPsCdS, полученных физико-химическими методами [5][6], подтолкнуло исследователей к изучению антимикробной активности биогенных наночастиц. Тестирование NPsCdS, синтезированных в присутствии клеток E. coli, показало подавление роста штаммов пищевых патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis, E. coli и гриба Aspergillus flavus, а также высокую цитотоксичность для раковых клеток меланомы Mus musculus (B16F10) и эпидермоидной карциномы человека (A431) по сравнению c 5-аминолевулиновой кислотой как стандартным противораковым препаратом [11]. NPsCdS/E. coli E-30 и NPsCdS/Klebsiella sp. K-6 были активнее, чем химически синтезированные наночастицы, в отношении бактерий Staphylococcus aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, E. coli, а также грибов Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Geotricum candidum. Причем ГП-штаммы были более чувствительными, чем ГО-штаммы [14]. Нами были получены схожие результаты при использовании для биосинтеза NPsCdS других штаммов, в частности S. oneidensis MR-1: ГП-тест-культуры оказались менее устойчивыми к действию NPsCdS/Shewanella, чем ГО-штаммы (таблица).

Такая разница в восприимчивости микроорганизмов, скорее всего, связана с природой строения их клеточной стенки, определяющей проницаемость бактерий [23]. Известно, что клеточные стенки ГП-бактерий содержат многослойный пептидогликан, ковалентно связанный с отрицательно заряженными цепями тейхоевой кислоты. Белки с отрицательным зарядом поверхности, вступая в электростатическое взаимодействие с положительными ионами Cd2+-наночастиц, облегчают проникновение последних через мембрану клеток и их дальнейшее разрушение [23]. В исследовании [24] ингибирующее действие NPsCdS на ГП-штаммы объясняют контактом Cd2+ с тиоловыми группами дыхательных ферментов бактерий, что приводит к производству активных форм кислорода и, как следствие, деструкции клеток.

Отсутствие или незначительная восприимчивость ГО-тест-штаммов к NPsCdS/Shewanella также сводится к особенности строения их клеточной стенки. ГО-бактерии имеют во внешней мембране липополисахариды, липидная часть которых действует как эндотоксин, препятствующий проникновению чужеродных макромолекул из окружающей клетку среды [23]. При этом небольшое подавление роста P. putida (таблица) можно объяснить малым размером ингибирующих наночастиц (5 ± 1 нм), поскольку с уменьшением размера нанообъекта увеличивается площадь поверхности взаимодействия с бактериальной клеткой [11].

Таким образом, доказана антибактериальная активность NPsCdS, полученных методологически простым и экологически безопасным внеклеточным синтезом.

Заключение

Разработан эффективный метод получения внеклеточных NPsCdS с использованием бактерий B. subtilis 168, S. oneidensis MR-1. Установлено, что наиболее продуктивной фазой для биосинтеза наночастиц является стационарная фаза роста исследуемых штаммов. Показана биоцидная активность NPsCdS, что позволяет рассматривать их в качестве нового класса противомикробных препаратов и терапевтических агентов в борьбе с мультирезистентными бактериями, что удовлетворяет современным тенденциям биомедицины.

1. Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар ОФС. 1.2.4.0010.18. М., 2018. 32 с.

Список литературы

1. Veerathangam K., Pandian M.S., Ramasamy P. Size-dependent photovoltaic performance of cadmium sulfide (CdS) quantum dots for solar cell applications. J. Alloys Compd. 2018; 735: 202–8. https://doi.org/10.1016/j.jallcom.2017.11.055

2. Садовников С.И., Гусев А.И., Ремпель А.А., ред. Полупроводниковые наноструктуры сульфидов свинца, кадмия и серебра. М.: Физматлит; 2018.

3. Moghaddam M., Naderi N., Hosseinifard M., Kazemzadeh A. Improved optical and structural properties of cadmium sulfide nanostructures for optoelectronic applications. Ceram. Int. 2020; 46(6): 7388–95. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2019.11.234

4. Cheng L., Xiang Q., Liao Y., Zhang H. CdS-based photocatalysts. Energy Environ. Sci. 2018; 11: 1362–91. https://doi.org/10.1039/C7EE03640J

5. Nivetha A., Mangala D., Prabha S.I. Fascinating physic-chemical properties and resourceful applications of selected cadmium nanomaterials. J. Inorg. Organomet. Polym. 2019; 29: 1423–38. https://doi.org/10.1007/s10904-019-01141-z

6. Mostafa A.M., Mwafy E.A., Hasanin M.S. One-pot synthesis of nanostructured CdS, CuS, and SnS by pulsed laser ablation in liquid environment and their antimicrobial activity. Opt. Laser Technol. 2020; 121: 105824. https://doi.org/10.1016/j.optlastec.2019.105824

7. Ullah M.W., Shi Z., Shi X., Zeng D., Li S., Yang G. Microbes as structural templates in biofabrication: study of surface chemistry and applications. ACS Sustainable Chem. Eng. 2017; 5(12): 11163–75. https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.7b02765

8. Gahlawat G., Choudhury A.R. A review on the biosynthesis of metal and metal salt nanoparticles by microbes. RSC Adv. 2019; 9: 12944–67. https://doi.org/10.1039/C8RA10483B

9. Feng Y., Marusak K.E., You L., Zauscher S. Biosynthetic transition metal chalcogenide semiconductor nanoparticles: progress in synthesis, property control and applications. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 2018; 38: 190–203. https://doi.org/10.1016/j.cocis.2018.11.002

10. Yang Z., Lu L., Berard V.F., He Q., Kiely C.J., Berger B.W., et al. Biomanufacturing of CdS quantum dots. Green Chem. 2015; 17: 3775–82. https://doi.org/10.1039/C5GC00194C

11. Shivashankarappa A., Sanjay K.R. Escherichia coli-based synthesis of cadmium sulfide nanoparticles, characterization, antimicrobial and cytotoxicity studies. Braz. J. Microbiol. 2020; 51(3): 939–48. https://doi.org/10.1007/s42770-020-00238-9

12. Kumar A., Singh A.K., Choudhary K.K., eds. Role of Plant Growth Promoting Microorganisms in Sustainable Agriculture and Nanotechnology. Elsevier Inc.; 2019.

13. Журавлева О.А., Воейкова Т.А., Хаддаж М.Х., Булушова Н.В., Исмагулова Т.Т., Бахтина А.В. и др. Бактериальный синтез наночастиц сульфидов кадмия и цинка. Характеристика и перспектива их применения. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(4): 191–8. https://doi.org/10.17116/molgen201836041191

14. Elsalam Abd S.S., Taha R.H., Tawfeik A.M., El-Monem Abd M.O., Mahmoud H.A. Antimicrobial activity of bio and chemical synthesized cadmium sulfide nanoparticles. Egypt. J. Hosp. Med. 2018; 70(9): 1494–507. https://doi.org/10.12816/0044675

15. Sankhla A., Sharma R., Yadav R.S., Kashyap D., Kothari S.L., Kachhwaha S. Biosynthesis and characterization of cadmium sulfide nanoparticles — an emphasis of zeta potential behavior due to capping. Mater. Chem. Phys. 2016; 170: 44-51. https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2015.12.017

16. Marusak K.E., Feng Y., Eben C.F., Payne S.T., Cao Y., You L., et al. Cadmium sulphide quantum dots with tunable electronic properties by bacterial precipitation. RSC Adv. 2016; 6(80): 76158–66. https://doi.org/10.1039/C6RA13835G

17. Qi P., Zhang D., Zeng Y., Wan Y. Biosynthesis of CdS nanoparticles: A fluorescent sensor for sulfate-reducing bacteria detection. Talanta. 2016; 147: 142–6. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2015.09.046

18. Sweeney R.Y., Mao C., Gao X., Burt J.L., Belcher A.M., Georgiou G., et al. Bacterial biosynthesis of cadmium sulfide nanocrystals. Chem. Biol. 2004; 11(11): 1553–9. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2004.08.022

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., ред. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.

20. Воейкова Т.А., Журавлева О.А., Грачева Т.С., Булушова Н.В., Исмагулова Т.Т., Шайтан К.В. и др. Оптимизация микробного синтеза наночастиц сульфида серебра. Биотехнология. 2017; 33(3): 38–46. https://doi.org/10.1016/10.21519/0234-2758-2017-33-3-38-46

21. Воейкова Т.А., Шебанова А.С., Иванов Ю.Д., Кайшева А.Л., Новикова Л.М., Журавлева О.А. и др. Роль белков внешней мембраны бактерии Shewanella oneidensis MR-1 в образовании и стабилизации наночастиц сульфида серебра. Биотехнология. 2015; 31(5): 41–8.

22. Воейкова Т.А., Журавлева О.А., Кулигин В.С., Иванов Е.В., Кожухова Е.И., Егоров А.С. и др. Природоподобный метод получения полимерных нанокомпозитов и изучение их физико-химических свойств. Вопросы материаловедения. 2019; (4): 113–23. https://doi.org/10.22349/1994-6716-2019-100-4-113-123

23. Alsaggaf M.S., Elbaz A.F., Badawy El S., Moussa S.H. Anticancer and antibacterial activity of cadmium sulfide nanoparticles by Aspergillus niger. Adv. Polym. Technol. 2020; 2020: 4909054. https://doi.org/10.1155/2020/4909054

24. Bhat Ul I.H., Yi Y.S. Green synthesis and antibacterial activity of cadmium sulfide nanoparticles (CdSNPs) using Panicum sarmentosum. Asian J. Green Chem. 2019; 3(4): 455–69. https://doi.org/10.33945/SAMI/AJGC.2019.4.3


Об авторах

О. А. Журавлева
Национальный исследовательский центр Курчатовский институт; Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Национальный исследовательский центр Курчатовский институт
Россия

Журавлева Ольга Алексеевна — кандидат химических наук, младший научный сотрудник лаб. Белковой инженерии группы нанобиотехнологий НИЦ Курчатовский институт и НИЦ Курчатовский институт — ГосНИИгенетика.

Москва



Т. А. Воейкова
Национальный исследовательский центр Курчатовский институт; Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Национальный исследовательский центр Курчатовский институт
Россия

Воейкова Татьяна Александровна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, старший научный сотрудник лаб. белковой инженерии группы нанобиотехнологий НИЦ Курчатовский институт и НИЦ Курчатовский институт — ГосНИИгенетика.

Москва



В. С. Кулигин
Национальный исследовательский центр Курчатовский институт; Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Национальный исследовательский центр Курчатовский институт
Россия

Кулигин Владислав Сергеевич — инженер-исследователь лаб. белковой инженерии группы нанобиотехнологий НИЦ Курчатовский институт; аспирант НИЦ Курчатовский институт — ГосНИИгенетика.

Москва



В. Г. Дебабов
Национальный исследовательский центр Курчатовский институт; Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Национальный исследовательский центр Курчатовский институт
Россия

Дебабов Владимир Георгиевич — доктор биологических наук, акад. РАН, проф., зав. лаб. белковой инженерии, научный руководитель Курчатовского комплекса генетических исследований НИЦ Курчатовский институт и НИЦ Курчатовский институт — ГосНИИгенетика.

Москва



Просмотров: 105


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)