Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Биологические свойства и генетическая характеристика экспериментальных диагностических бактериофагов Vibrio cholerae

https://doi.org/10.36233/0372-9311-39

Полный текст:

Аннотация

Актуальность. В настоящее время проводится работа по конструированию новых диагностических и профилактических препаратов на основе бактериофагов, поэтому актуально изучение биологических свойств холерных фагов наравне с их генетической структурой. Эта информация необходима для прогнозирования жизненного цикла фага и оценки перспектив практического использования в экспериментальной деятельности, фагодиагностике или фагопрофилактике.

Материалы и методы. Наличие или отсутствие генов, характерных для умеренных бактериофагов, проверяли при помощи созданной авторами базы данных и программного обеспечения «PhageAnalyzer», позволяющего проводить быстрый анализ данных полногеномного секвенирования бактериофагов и прогнозировать их жизненный цикл.

Результаты и обсуждение. Морфологическая структура экспериментальных диагностических холерных фагов представлена головчатыми бактериофагами различных морфогрупп. Негативные колонии фагов различались по диаметру, форме и степени прозрачности. В геномах бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3 генетических детерминант факторов резистентности и токсинов не обнаружено. В результате филогенетического анализа определено, что исследованные холерные экспериментальные бактериофаги имеют сходство с головчатыми фагами из рода Vibrio, но являются уникальными, т.к. находятся «вне кластерных групп». Vibrio фаги Rostov-1 и Rostov M3 являются литическими. У холерных фагов Rostov-6 и Rostov 7 найдены гены, характерные для умеренных бактериофагов.

Заключение. Экспериментальный холерный бактериофаг Rostov-1 может быть использован для дифференциации холерного вибриона О1 серогруппы биовара El Tor, а Vibrio фаг Rostov M3 — для биовара Classical. Оба бактериофага являются литическими и перспективными компонентами для создания профилактических препаратов против холеры. Vibrio фаги Rostov-6 и Rostov 7 могут быть успешно использованы только в экспериментальной деятельности, а также при мониторинге холерных вибрионов из окружающей среды. Полные геномные последовательности зарегистрированы и доступны в международной базе GenBank (NCBI).

Введение

Холера представляет значительную угрозу для здравоохранения и выявляется не только в эндемичных регионах [1][2]. Детальное изучение бактериофагов имеет как теоретическое, так и важное практическое значение. Бактериофаги используют для разработки эффективных методов фагодиагностики и фагопрофилактики возбудителей различных заболеваний, в том числе холеры. Вирулентные формы фагов являются одним из основных элементов биологической борьбы с бактериальной инфекцией [3][4]. Только вирулентные бактериофаги могут применяться в составе профилактических препаратов, поскольку воздействие умеренных бактериофагов на культуру фагочувствительных бактериальных клеток приводит к образованию фагорезистентных вариантов. На сегодняшний день обнаружено множество генов, характерных для умеренных бактериофагов, которые могут быть встроены в геном. Наиболее информативным методом для выявления генетических детерминант умеренных бактериофагов является полногеномное секвенирование [5][6].

Цель исследования — изучение биологических свойств и генетических характеристик холерных бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3, входящих в число экспериментальных диагностических бактериофагов Vibrio cholerae О1 серогруппы биоваров El Tor и Classical.

Материалы и методы

В исследование взяты бактериофаги Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3, входящие в число экспериментальных диагностических бактериофагов V. cholerae О1 серогруппы биоваров El Tor и Classical. Бактериофаги выделены из водных объектов окружающей среды и находятся в коллекции холерных фагов лаборатории бактериофагов Ростовского-на-Дону противочумного института.

Изучение биологических свойств проводили общепринятыми методами [7]. Для подготовки к электронно-микроскопическому исследованию препарат бактериофагов центрифугировали, отбирали супернатант и вносили в него полиэтиленгликоль 6000. Далее центрифугировали, удаляли супернатант, а осадок ресуспендировали деионизованной водой. Затем наносили препарат на сеточки для электронной микроскопии и контрастировали 2% водным раствором уранилацетата. После высушивания образцы просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе «JEM-1011» («JEOL»). Электронограммы получены при помощи CDC-камеры «Olimpus-SlS-Veleta» («Olimpus») и программного обеспечения «iTEM-TEMimagingPlatform» («ResAlta»).

ДНК фагов выделяли в соответствии с ранее описанными методиками [8][9][10]. Количество и качество выделенной ДНК контролировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Качество полученных препаратов фаговой ДНК исследовали, подвергая их гидролизу эндонуклеазами рестрикции, а также в ПЦР. Отсутствие бактериальных хромосом в пробах подтверждали методом ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров для определения фрагментов ДНК hly и ctx+. Раствор фаговой ДНК хранили при –20ºС.

Геномную последовательность бактериофагов определяли с использованием одного из методов высокопроизводительного секвенирования. ДНК фагов секвенирована с помощью полногеномного секвенатора «Miseq» («Illumina»).

Первичные данные секвенирования оценивали с использованием программы «FastQC» [11]. Для тримминга и коррекции ридов применяли алгоритмы Trimmomatic [12] и Lighter [13]. Сборку геномов, представленных в виде ридов, проводили в программе «Spades» [14]. Собранные геномы бактериофагов сравнивали с аннотированными последовательностями известных бактериофагов при помощи алгоритма BLASTN 2.2.291. Наличие или отсутствие генов, характерных для умеренных бактериофагов (генетических детерминант факторов резистентности, токсинов и интеграз), проверяли при помощи созданной нами базы данных и разработанного программного обеспечения «PhageAnalyzer»2, позволяющего проводить быстрый анализ данных полногеномного секвенирования бактериофагов и прогнозировать их жизненный цикл.

Результаты

Исследование методом электронной микроскопии показало, что экспериментальные бактериофаги — головчатые, но относятся к различным морфогруппам и семействам (табл. 1).

Таблица 1. Морфология исследованных фаговых корпускул
Table 1. Morphology of the studied phage corpuscles

Холерные бактериофаги Rostov-1 и Rostov 7 активны в отношении V. cholerae серогруппы O1 биовара El Tor с диапазоном литической активности 57,5 и 66,3% соответственно. На газоне индикаторной культуры Vibrio фаг Rostov-1 образует колонии двух типов: мелкие (диаметром 1,0–1,5 мм) и крупные (3,0–6,0 мм) (рис. 1), а Vibrio фаг Rostov 7 образует прозрачные негативные колонии (1,0–1,5 мм).

Рис. 1. Негативные колонии, образуемые на газоне индикаторной культуры V. cholerae О1 серогруппы биовара El Tor бактериофагом Rostov-1.
Fig. 1. Negative colonies formed on the lawn of the indicator culture of V. cholerae O1 serogroup of the El Tor biovar bacteriophage Rostov-1.

Бактериофаг Rostov М3 активен в отношении холерного вибриона О1 серогруппы биовара Classical с диапазоном литической активности 83,3%. На газоне индикаторной культуры бактериофаг Rostov М3 образует прозрачные негативные колонии диаметром 1,5–2,0 мм. В свою очередь, Vibrio фаг Rostov-6 активен в отношении V. cholerae О1 серогруппы биоваров Classical и El Tor, в том числе к антибиотикоустойчивому штамму V. cholerae El Tor 19243 (стрептомицин, фуразолидон, триметоприм/сульфаметоксазол, налидиксовая кислота) со спектром литической активности 64,6%. На газоне индикаторной культуры Vibrio фаг Rostov-6 образует прозрачные негативные колонии диаметром 1,0–1,5 мм.

Исследованные фаги устойчивы к воздействию хлороформа и инактивируются при 60ºС в течение 30 мин. Специфичность экспериментальных бактериофагов в отношении хозяина подтверждена на большом наборе представителей близкородственных микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, которые не лизировались испытуемыми фагами.

Результаты, полученные при секвенировании геномов холерных экспериментальных бактериофагов, показали, что размеры их геномов колеблются от 37 до 47 тыс. пар нуклеотидов (табл. 2).

Таблица 2. Анализ последовательностей геномов холерных экспериментальных бактериофагов
Table 2. Sequence analysis of the genomes of the experimental cholera bacteriophages

По данным биоинформационного анализа ДНК исследованных бактериофагов, в их составе выявлены гены, характерные для головчатых фагов V. cholerae (табл. 3).

Таблица 3. Геномы головчатых фагов, представленные в базе данных GenBank (NCBI)
Table 3. Genomes of head phages available in GenBank database (NCBI)

Обсуждение

Морфологический анализ методом электронной микроскопии показал, что исследованные бактериофаги являются головчатыми. Эти данные подтверждает анализ нуклеотидных последовательностей и относит экспериментальные диагностические холерные бактериофаги к ДНК-содержащим хвостатым фагам. Размеры геномов бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov М3 достаточно большие, в них обнаружены гены, характерные для головчатых фагов рода Vibrio (табл. 3).

Бактериофаги Rostov-1 и Rostov 7 обладают способностью лизировать более широкий спектр штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара El Tor по сравнению с другими холерными фагами El Tor. Фаг Rostov M3 активен в отношении V. cholerae О1 серогруппы биовара Classical с большим диапазоном литической активности. Холерный бактериофаг Rostov-6 также имеет высокий спектр литической активности и уникален тем, что активен в отношении V. cholerae O1 серогруппы биоваров как Classical, так и El Tor, в том числе антибиотикоустойчивого штамма V. сholerae El Tor 19243.

После сравнения генома бактериофага Rostov-1 с имеющимися в базе данных GenBank генами других фагов из группы Vibrio phage обнаружено, что только 23 открытых рамки считывания (ORF) имеют установленные функции. Гомологичные последовательности в известных бактериальных геномах не обнаружены. Установлено, что вибриофаг Rostov-1 является литическим, т.к. в результате биоинформационного анализа не обнаружено генов, характерных для умеренных бактериофагов.

В геноме бактериофага Rostov-6 идентифицированы 13 последовательностей, гомологичных бактериальным, что составляет бóльшую часть генома. Также обнаружены 2 ORF, которые гомологичны фаговым. Бактериофаг Rostov-6 считается умеренным, потому что в нём обнаружена интеграза (YP_009153053.1) с гомологией 96,6%.

Бактериофаг Rostov 7 имеет 28 ORF из рода Vibrio и 7 ORF из других родов с установленными функциями. Обнаружены гомологичные последовательности в известных бактериальных геномах — гипотетические белки гамма-протеобактерий и профаг Bacillus subtilis. Поскольку в геноме найдены 2 интегразы с гомологией 96,6% (YP_009043902.1) и 94% (YP_009043892.1), бактериофаг Rostov 7 является умеренным.

Анализ нуклеотидных последовательностей фага Rostov M3 показал, что в геноме 50 ORF, и все они принадлежат роду Vibrio. После анализа данных, предоставленных системой BLASTN, обнаружены 3 бактериофага, гомологичные Rostov M3, относящиеся к тому же семейству Myoviridae [16]. Из них 2 фага Vibrio vB_VchM-138 и Vibrio phage 24, идентичные Rostov M3 на 99,08 и 98,31% соответственно, являются литическими, организм-хозяин — V. cholerae О1 серогруппы биовара Classical. Данные фаги описаны как диагностические, а также перспективные для фаготерапии [5][17]. Третий Vibrio фаг CP-T1 идентичен Rostov M3 на 98,31%, но является умеренным и способен размножаться на обоих биоварах V. cholerae О1 Classical и El Tor [18]. Генетические детерминанты факторов резистентности, токсинов и интеграз не обнаружены, значит он является литическим.

Анализируя дендрограмму (рис. 2), следует отметить общность сходства исследованных экспериментальных диагностических бактериофагов с головчатыми фагами V. cholerae и принадлежность к данному семейству, но обособленное положение «вне кластерных групп» указывает на их уникальность.

Рис. 2. Филогенетический анализ исследованных фаговых геномов.
Fig. 2. Phylogenetic analysis of genomes of the studied phages.

Исследованные фаги имеют высокий процент сходства с геномами бактериофагов, представленных в базе данных GenBank, — 83–99%, но все же являются уникальными. Аннотированные последовательности фагов зарегистрированы в международной базе GenBank (табл. 4).

Таблица 4. Зарегистрированные геномы исследованных бактериофагов
Table 4. Deposited genomes of the studied bacteriophages

Заключение

Морфологическая структура экспериментальных диагностических холерных фагов представлена головчатыми бактериофагами различных морфогрупп. Негативные колонии фагов различались по диаметру, форме и степени прозрачности.

В геномах бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3 генетических детерминант факторов резистентности и токсинов не обнаружено. В результате филогенетического анализа стало известно, что имеют сходство исследованные холерные экспериментальные бактериофаги с головчатыми фагами из рода Vibrio, но являются уникальными, т.к. находятся «вне кластерных групп».

Экспериментальный холерный бактериофаг Rostov-1 может быть использован для дифференциации холерного вибриона О1 серогруппы биовара El Tor, а Vibrio phage Rostov M3 — для биовара Classical. Выявлено, что оба бактериофага не содержат генетических детерминант, которые характерны для умеренных фагов. Холерные бактериофаги Rostov-1 и Rostov M3 являются литическими и перспективными компонентами для создания профилактических препаратов против холеры.

В структуре генома Vibrio phage Rostov-6 и Rostov 7 найдены интегразы, поэтому использование фагов в профилактических препаратах исключено, т.к. они являются умеренными. Данные бактериофаги могут быть успешно использованы при мониторинге холерных вибрионов из окружающей среды, а также в экспериментальной деятельности.

Таким образом, была осуществлена биологическая и генетическая характеристика холерных бактериофагов Rostov-1, Rostov-6, Rostov 7 и Rostov M3. Полные геномные последовательности зарегистрированы и доступны в международной базе GenBank.

1. URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

2. Погожова М.П., Водопьянов А.С., Гаевская Н.Е. и др. PhageAnalyzer — программа для анализа данных полногеномного секвенирования бактериофагов. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2019616060 от17.05.2019. Available at: http://antiplague.ru/phageanalyzer/

Список литературы

1. Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Кругликов В.Д., Титова С.В., Водопьянов А.С., Куриленко М.Л. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2008-2017 гг. Прогноз на 2018 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1): 36–43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43

2. Centers for Disease Control and Prevention. 2010. Update: cholera outbreak – Haiti, 2010. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2010; 59(45): 1473–9.

3. Yen M., Cairns L.S., Camilli A. A cocktail of three virulent bacteriophages prevents Vibrio cholerae infection in animal models. Nat. Commun. 2017; 8: 14187. https://doi.org/10.1038/ncomms14187

4. D'Andrea M.M., Marmo P., Henrici De Angelis L., Palmieri M., Ciacci N., Di Lallo G., et al. φBO1E, a newly discovered lytic bacteriophage targeting carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae of the pandemic Clonal Group 258 clade II lineage. Sci. Rep. 2017; 7(1): 2614. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02788-9

5. Bhandare S.G., Warry A., Emes R.D., Hooton S.P.T., Barrow P.A., Atterbury R.J. Complete genome sequences of Vibrio cholerae-specific Bacteriophages 24 and X29. Genome Announc. 2017; 5(46): e01013–17. https://doi.org/10.1128/genomea.01013-17

6. Comeau A.M., Tremblay D., Moineau S., Rattei T., Kushkina A.I., Tovkach F.I., et al. Phage morphology recapitulates phylogeny: the comparative genomics of a new group of myoviruses. PloS One. 2012; 7(7): e40102. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040102

7. Adams M.H. Bacteriophages. New York: Inter science Publishers; 1959.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., ред. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.

9. Габрилович И.М. Практическое пособие по бактериофагии. Минск: Вышэйшая школа; 1968.

10. Yamamoto K.R., Alberts B.M., Berzinger R., Lawhorne L., Treiber G. Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethylene glycol and its application to large-scale virus purification. Virology. 1970; 40(3): 734–44. https://doi.org/10.1016/0042-6822(70)90218-7

11. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data 2010. Available at: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc

12. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114–20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170

13. Song L., Florea L., Langmead B. Lighter: fast and memoryefficient sequencing error correction without counting. Genome Biol. 2014; 15(11): 509. https://doi.org/10.1186/s13059-014-0509-9

14. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A.A., Dvorkin M., Kulikov A.S., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 2012; 19(5): 455–77. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021

15. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.; 1968.

16. Ackerman H.B. Bacteriophage taxonomy in 1987. Microbiol. Sci. 1987; 4(7): 214–8.

17. Comeau A.M., Tremblay D., Moineau S., Rattei T., Kushkina A.I., Tovkach F.I., et al. Phage morphology recapitulates phylogeny: the comparative genomics of a new group of myoviruses. PloS One. 2012; 7(7): e40102. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040102

18. Guidolin A., Morelli G., Kamke M., Manning P.A. Vibrio cholerae bacteriophage CP-T1: characterization of bacteriophage DNA and restriction analysis. J. Virol. 1984; 51(1): 163–9. https://doi.org/10.1128/jvi.51.1.163-169.1984


Об авторах

М. П. Погожова
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Погожова Марина Павловна — м.н.с. лаб. бактериофагов

Ростов-на-Дону



Н. Е. Гаевская
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Гаевская Наталья Евгеньевна — к.м.н., в.н.с., и.о. зав. лаб. бактериофагов

Ростов-на-Дону



А. С. Водопьянов
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Водопьянов Алексей Сергеевич — к.м.н., и.о. зав. группой вирусологии

Ростов-на-Дону



Р. В. Писанов
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Писанов Руслан Вячеславович — к.б.н., и.о. зав. лаб. диагностики особо опасных инфекций

Ростов-на-Дону



А. О. Аноприенко
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Аноприенко Анна Олеговна — м.н.с. лаб. бактериофагов

Ростов-на-Дону



Л. В. Романова
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Романова Людмила Васильевна — д.б.н., с.н.с. лаб. биохимии микробов

Ростов-на-Дону



А. В. Тюрина
Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Россия

Тюрина Анна Владимировна — м.н.с. лаб. бактериофагов

Ростов-на-Дону



Просмотров: 129


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)