Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Механизм персистенции индигенных бифидобактерий под действием ацетата в кишечном биотопе человека

https://doi.org/10.36233/0372-9311-86

Полный текст:

Аннотация

Цель исследования — определить роль ацетата в персистенции индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе через лизоцимрезистентность в модельных условиях ацетилирования–деацетилирования пептидогликана.

Материалы и методы. Исследовано по 16 штаммов двух видов индигенных бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum subsp. longum. Бифидобактерии культивировали в СO2-инкубаторе при cодержании O2 0,6%, CO2 9% и температуре 37ºС в течение 48 ч. Продукцию уксусной кислоты (ацетата) бифидобактериями выявляли методом газовой хроматографии. Влияние ацетата на устойчивость неиндигенных грамположительных бактерий к лизоциму определяли на модели штамма Listeria monoytogenes ICIS-280 путём культивирования в бульоне LB-Lennox с добавлением ацетата аммония в диапазоне концентраций, продуцируемых исследуемыми бифидобактериями, в серии разведений лизоцима в конечных концентрациях от 5 до 40 мкг/мл в течение 24 ч.

Результаты. Установлено, что у Bifidobacterium longum subsp. longum выделение ацетата в среднем было в 2 раза выше, чем у Bifidobacterium bifidum (14,7 и 27 ммоль/л соответственно), и вполне соответствовало концентрациям уксусной кислоты, определённым в кишечном содержимом (до 50 ммоль/л). Культивирование бифидобактерий в среде с лизоцимом, ацетатом аммония и их сочетанием не оказало существенного влияния на их показатели роста при максимальных использованных концентрациях данных веществ. У тест-штамма добавление ацетата аммония в диапазоне, создаваемом бифидобактериями, вызывало снижение минимальной подавляющей концентрации лизоцима более чем в 2 раза — от 40 до менее 20 мкг/мл. В контрольной среде без лизоцима не отмечено ингибирования роста индикаторной культуры вплоть до максимальных концентраций ацетата аммония.

Заключение. Выявлен механизм персистенции (выживания) индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе человека путём продукции ацетата, избирательно подавляющего лизоцимрезистентность неиндигенных грамположительных бактерий, за счёт обратимости деацетилирования пептидогликана, что позволяет индигенным бифидобактериям сохранять стабильное доминантное положение в биотопе.

Введение

Среди биотопов организма человека толстый кишечник отличается исключительно высокой численностью и разнообразием микроорганизмов. Данные об их экологической структуре, механизмах и условиях формирования всё ещё характеризуются существенной неполнотой и противоречивостью. В данном биотопе обращают на себя внимание бактерии рода Bifidobacterium, которые важны для нормального функционирования пищеварительного тракта человека [1] и дискриминации в организме патогенов [2].

Главным конечным метаболитом индигенных бифидобактерий является уксусная кислота [3]. Ранее было показано, что именно её продукция предотвращает летальную инфекцию энтеропатогенных Escherichia coli [4]. Однако механизм протективного эффекта метаболитов бифидобактерий в отношении патогенной или условно-патогенной грамположительной микробиоты не изучен.

Известно, что в основе формирования симбиотических взаимодействий бактерий с хозяином лежит явление персистенции (длительного выживания микроорганизмов в организме хозяина), где ключевой биомишенью иммунитета является клеточная стенка — её пептидогликан (ПГ) [5], а разрушает ПГ фермент лизоцим. В случае грамположительных бактерий ПГ открыт для иммунной системы хозяина (не защищен). Единственный описанный к настоящему времени механизм обеспечения устойчивости грамположительных бактерий к ферментативному действию лизоцима — модификация ПГ [6].

Известны два наиболее распространённых пути такой модификации:

1) O-ацетилирование ПГ, встречающееся как у грамположительных, так и у некоторых грамотрицательных бактерий [7], обеспечивающее толерантность к лизоциму ПГ Bifidobacterium longum [8];

2) де-N-ацетилирование ПГ, выявляемое только у грамположительных бактерий.

Наше внимание обратил на себя тот факт, что де-N-ацетилазы ПГ выявлялись преимущественно у микроорганизмов, которые нельзя было отнести к резидентной микробиоте человека, в частности бацилл, клостридий [9] и листерий. Однако именно этот механизм обеспечивал основной вклад в их лизоцимрезистентность [10].

Оба механизма включали уксусную кислоту, но в разнонаправленном качестве. В случае O-ацетилирования её остаток (ацетат) присоединяется к остатку N-ацетилмурамовой кислоты ПГ, а в случае де-N-ацетилирования — отщепляется от остатка N-ацетилглюкозамина ПГ. При этом фермент де-N-ацетилаза ПГ, относящийся к 4-му семейству эстераз углеводов, подобно деацетилазе хитина, также является обратимым [11]. Поэтому избыточный ацетат в среде способен смещать равновесие реакции деацетилирования в сторону интактного ПГ. Другими словами, свободный ацетат может блокировать устойчивость к лизоциму чужеродных для кишечника человека грамположительных бактерий.

Цель исследования — определить роль ацетата в персистенции индигенных бифидобактерий в кишечном биотопе через лизоцимрезистентность в модельных условиях ацетилирования–деацетилирования ПГ.

Материалы и методы

Объекты исследования

На первом этапе работы были отобраны 16 штаммов двух наиболее распространённых видов индигенных бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum subsp. longum, выделенных ранее после получения информированного согласия от условно здоровых лиц (по 1 штамму от каждого обследуемого) в лаборатории инфекционной симбиологии ИКВС УрО РАН в рамках исследования «Диагностический цитокиновый маркер бесплодия мужчин — интерлейкин 4» (протокол заседания локального комитета по биоэтике ИКВС УрО РАН от 21.04.2021 № 1). Штаммы идентифицировали по культурально-морфологическим признакам, биохимическим свойствам с использованием набора «ANAEROtest-23» («LaChema») и по белковому профилю методом MALDI-TOF на масс-спектрометре «Microflex» («Bruker Daltonics»).

Определение ацетат-продукции бифидобактериями

С целью установления диапазона концентраций ацетата, создаваемого индигенными бифидобактериями кишечника, определяли уровень его продукции in vitro методом газовой хроматографии. Бифидобактерии вносили в количестве 108 КОЕ в объёме 0,1 мл бактериальной взвеси в 0,9% растворе NaCl в 4,9 мл бульона Shaedler («HiMedia») и культивировали в СO2 -инкубаторе («Binder») при cодержании О2 0,6%, СО2 9% и температуре 37ºС в течение 48 ч. Пробы центрифугировали при 13 600g в течение 15 мин, к 500 мкл супернатанта добавляли 50 мкл 98% серной кислоты («Panreac»). Экстракцию летучих жирных кислот из образцов осуществляли в 750 мкл изобутилового спирта («SigmaAldrich»), процесс повторяли дважды. Детекцию ацетата проводили в газожидкостном хроматографе «GC-2010 Plus» («Shimadzu»), оборудованном пламенно-ионизационным детектором с капиллярной колонкой HP-FFAP («Agilent Technologies») диаметром 0,32 мм, длиной 50 м. Температура испарителя составила 240ºС; температурная программа для капиллярной колонки: 0 мин — 70ºС, 10 мин — 160ºС, 5 мин — 180ºС и 25 мин — 240ºС; температура детектора — 260ºС. В качестве газа-носителя использован гелий, скорость газа-носителя — 21 см/с. Расчёт концентраций по площадям пиков осуществляли с помощью программного обеспечения «GCsolution» («Shimadzu»).

Определение влияния ацетата на уровень лизоцимрезистентности бактерий

Устойчивость бактерий к лизоциму определяли путём культивирования в бульоне LB-Lennox с добавлением серии разведений лизоцима куриного яичного белка («Sigma») в конечных концентрациях 5–40 мкг/мл в 3 повторах.

Среди грамположительных неиндигенных бактерий в качестве индикатора нами была выбрана тест-культура Listeria monocytogenes (штамм ICIS-280), поскольку для данного вида наиболее полно описана роль де-N-ацетилазы ПГ в обеспечении устойчивости к C-лизоциму [10]. Модельные условия инкубации тест-штамма: в бульоне LB-Lennox при 37ºС в течение 24 ч в серии разведений лизоцима, идентичных указанным для бифидобактерий.

Для определения влияния ацетата на устойчивость исследуемых бактерий к лизоциму использовали нейтральную соль уксусной кислоты — ацетата аммония, добавленную в среду культивирования в диапазоне молярных концентраций ацетата, создаваемых исследованными штаммами бифидобактерий. Наличие роста тест-штамма определяли фотометрически на микропланшетном фотометре «Multiscan Ascent» при длине волны 450 нм и превышении оптической плотности (ОП) культуральной среды над таковой у контрольного стерильного бульона более чем на 0,01. Статистический анализ проводили с использованием критерия U Манна– Уитни [12] в программе «Minitab 14.1».

Результаты

Характеристика ацетат-продукции индигенных бифидобактерий

У бактерий вида B. bifidum выделение уксусной кислоты варьировало в диапазоне 6,4–38,5 ммоль/л, тогда как у штаммов, принадлежащих к B. longum subsp. longum, выделение ацетата в среднем было в 2 раза выше (p < 0,01), варьировало в пределах 11,2– 50,6 ммоль/л (таблица) и вполне соответствовало концентрациям уксусной кислоты, определённым в кишечном содержимом [13].

Характеристика продукции ацетата исследуемыми штаммами бифидобактерий (M ± m)
Characteristics of the acetate production of the studied bifidobacteria strains (M ± m)


Примечание. Выделены штаммы, подвергнутые полногеномному секвенированию.
Note. The strains with available complete genome sequences are emphazied.

В то же время максимальные уровни продукции ацетата у B. bifidum оказались на 10 ммоль/л выше среднего уровня, определённого для B. longum subsp. longum, но гомологов любого из 7 генов 2 систем активного транспорта фруктозы, маннозы и рибозы, описанных как ключевые детерминанты высокого уровня продукции ацетата бифидобактериями [4], не было выявлено ни в секвенированном ранее геноме штамма с рекордным уровнем ацетатпродукции (B. bifidum ICIS-310; NCBI BioProject accession: PRJNA345151), ни в одном из других секвенированных штаммов B. bifidum, депонированных в базах данных NCBI [14]. При этом в геноме штамма со средним уровнем продукции ацетата 28,3 ммоль/л (B. longum subsp. longum ICIS-505; NCBI BioProject accession: PRJNA379379) все данные детерминанты присутствовали в том же виде, что и в геномах типовых штаммов B. longum MC-42 и B. longum NCC2705. Данные факты показывают, что высокая интенсивность продукции уксусной кислоты бифидобактериями может быть обеспечена не только при наличии указанных в работе [4] генетических детерминант мембранного транспорта углеводов.

Влияние ацетата на лизоцимрезистентность индикаторного штамма

Для оценки влияния ацетата на лизоцимрезистентность бактерий, деацетилирующих свой ПГ, проведено определение минимальной подавляющей концентрации лизоцима у тест-штамма Listeria monocytogenes в средах с добавлением ацетата аммония и лизоцима в 3 повторах. В качестве критерия роста культуры использовали повышение ОП контрольного штамма. В средах с комбинированным добавлением лизоцима и ацетата аммония в диапазоне, создаваемом индигенными бифидобактериями, отмечено снижение МПК лизоцима для штамма-индикатора более чем в 2 раза — от 40 до менее чем 20 мкг/мл (рис. 1). Устойчивость листерий к лизоциму в контрольной среде без добавления ацетата аммония не превышала 50 мкг/мл (положительный контроль). В контрольной среде без лизоцима (отрицательный контроль) не отмечено ингибирования роста индикаторной культуры вплоть до максимальных концентраций добавляемого ацетата аммония (50 ммоль/л).

Рис. 1. Влияние ацетата аммония на минимальную подавляющую концентрацию лизоцима индикаторного штамма Listeria monocytogenes ICIS-280.
Fig. 1. Effect of the ammonium acetate on lysozyme minimum inhibitory concentration of the model strain Listeria monocytogenes ICIS-280.

Таким образом, полученный результат согласуется с описанным эффектом обратимости реакции деацетилирования углеводов [11]. Избыток ацетата в среде смещает реакцию деацетилирования ПГ бактерий в сторону исходного (нативного) состояния, чувствительного к лизоциму. Обнаружено, что ацетат, продуцируемый бифидобактериями, индигенными для биотопа, в условиях физиологических значений кислотности также способен реализовать описанный эффект на модельной системе — тест-культуре де-N-ацетилирующих свой ПГ бактерий.

Характеристика лизоцимрезистентности индигенных бифидобактерий

Культивирование исследуемых штаммов индигенных бифидобактерий (ICIS-216, ICIS-310, ICIS-505) в среде с лизоцимом и ацетатом аммония не показало существенного отличия их показателей роста (p > 0,05) в контрольном бульоне от таковых в среде с добавлением максимальных использованных концентраций данных веществ (40 мкг/мл лизоцима и 50 ммоль/л ацетата аммония): 1,07 ± 0,05 и 1,01 ± 0,03 ед. ОП у штамма ICIS-216; 0,72 ± 0,07 и 0,8 ± 0,05 ед. ОП у штамма ICIS-310; 0,63±0,2 и 0,63±0,6 ед. ОП у штамма ICIS-505 соответственно.

Полученные данные свидетельствуют, что устойчивость к лизоциму у индигенных бифидобактерий не связана с наличием ацетата в среде, что согласуется с механизмом обеспечения их лизоцимрезистентности при O-ацетилировании ПГ — избыток ацетата в среде не оказывает подавляющего влияния на реакцию ацетилирования.

Обсуждение

Совокупность полученных данных свидетельствует, что продукция ацетата индигенными бифидобактериями обеспечивает не только уже известную устойчивость биотопа к ряду грамотрицательных патогенов, но и осуществляет дискриминацию неиндигенных грамположительных бактерий. При этом требуемый уровень данной продукции обеспечивается не только штаммами-носителями известных детерминант систем активного транспорта фруктозы, маннозы и рибозы, но и наблюдается у некоторых штаммов широко распространённого в кишечнике человека вида B. bifidum, не обладающего ими.

Проведённый анализ позволил нам составить схему механизма персистенции индигенных бифидобактерий (рис. 2):

1. Попадая в пищеварительный тракт, ПГ грамположительных бактерий напрямую контактирует с лизоцимом хозяина. Микроорганизмы с нативным, немодифицированным, ПГ элиминируются [15] — «первичный фильтр» микросимбионтов.

2. В толстом кишечнике бактерии, прошедшие лизоцимный, кислотный и протеолитический фильтры, в дополнение к лизоциму хозяина встречают значительные количества ацетата, выделяемого индигенными бифидобактериями и их метаболическими ассоциантами (бактероидами) [3]. Присутствие ацетата в среде смещает равновесие обратимой реакции деацетилирования [11], катализируемой де-N-ацетилазой неиндигенной микробиоты в сторону немодифицированного ПГ бактерий, что оставляет его чувствительным к действию лизоцима [10], возвращаясь к элиминации его носителей — «вторичный фильтр» микросимбионтов.

К тому же, как показано нами, этот эффект наблюдался при физиологических концентрациях ацетата, образующихся в биотопе.

3. О-ацетилирование ПГ бактерий сохраняет свою работоспособность в присутствии ацетата и обеспечивает персистенцию реализующих его микроорганизмов, включая бифидобактерии [8], которые таким образом формируют пул индигенной микробиоты данного биотопа.

Рис. 2. Схема отбора грамположительных бактерий в толстом кишечнике по механизмам их лизоцим-резистентности.
Fig. 2. Selection of gram-positive bacteria in the large intestine by the mechanism of their lysozyme resistance.

В связи с этим низкий уровень антилизоцимной активности, определяемый у бифидобактерий [2], оказывается закономерным, усиливая их селективное преимущество в толстом кишечнике. Таким образом, выделяясь в процессе катаболизма бифидобактериями, ацетат способствует изменению функционирования механизма персистенции бактерий-ассоциантов, выполняя по сути функцию регулятора лизоцимрезистентности в биотопе.

Заключение

Выявлен механизм персистенции индигенной бифидофлоры через альтернативную модификацию ПГ микроорганизмов, где ацетат является ключевым регулятором, определяющим доминантную роль бифидобактерий в кишечном биотопе хозяина, обеспечивая как первичную дискриминацию неиндигенных кишечных ассоциантов через блокирование де-N-ацетилирования их ПГ, так и сохранение индигенной грамположительной микробиоты с О-ацетилированием ПГ. Учёт роли подобного биохимического регулятора в биоценозе может способствовать повышению эффективности мер по коррекции и предупреждению дисбиотических состояний.

Список литературы

1. Ventura M., Turroni F., Lugli G.A., van Sinderen D. Bifidobacteria and humans: our special friends, from ecological to genomics perspectives. J. Sci. Food Agric. 2014; 94(2): 163–8. https://doi.org/10.1002/jsfa.6356

2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б, Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. Екатеринбург; 2014.

3. Rios-Covian D., Cuesta I., Alvarez-Buylla J.R., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., de Los Reyes-Gavilán C.G. Bacteroides fragilis metabolises exopolysaccharides produced by bifidobacteria. BMC Microbiol. 2016; 16(1): 150. https://doi.org/10.1186/s12866-016-0773-9

4. Fukuda S., Toh H., Taylor T.D., Ohno H., Hattori M. Acetateproducing bifidobacteria protect the host from enteropathogenic infection via carbohydrate transporters. Gut Microbes. 2012; 3(5): 449–54. https://doi.org/10.4161/gmic.21214.

5. Vollmer W., Blanot D., de Pedro M.A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 2008; 32(2): 149–67. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00094.x

6. Андрющенко С.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В. Молекулярные механизмы взаимодействия бактерий с лизоцимом и их роль в микросимбиоценозе. Успехи современной биологии. 2015; 135(5): 453–63.

7. Pfeffer J.M., Strating H., Weadge J.T., Clarke A.J. Peptidoglycan O acetylation and autolysin profile of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. J. Bacteriol. 2006; 188(3):902–8. https://doi.org/10.1128/jb.188.3.902-908.2006

8. Sakurai T., Hashikura N., Minami J., Yamada A., Odamaki T., Xiao J.Z. Tolerance mechanisms of human-residential bifidobacteria against lysozyme. Anaerobe. 2017; 47: 104–10. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2017.05.001

9. Ho T.D., Williams K.B., Chen Y., Helm R.F., Popham D.L., Ellermeier C.D. Clostridium difficile extracytoplasmic function σ factor σV regulates lysozyme resistance and is necessary for pathogenesis in the hamster model of infection. Infect. Immun. 2014; 82(6): 2345–55. https://doi.org/10.1128/IAI.01483-13.

10. Rae C.S., Geissler A., Adamson P.C., Portnoy D.A. Mutations of the Listeria monocytogenes peptidoglycan N-deacetylase and O-acetylase result in enhanced lysozyme sensitivity, bacteriolysis, and hyperinduction of innate immune pathways. Infect. Immun. 2011; 79(9): 3596–606. https://doi.org/10.1128/iai.00077-11

11. Aragunde H., Biarnés X., Planas A. Substrate recognition and specificity of chitin deacetylases and related family 4 carbohydrate esterases. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19(2): 412. https://doi.org/10.3390/ijms19020412.

12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Медгиз; 1962.

13. Sze M.A., Topçuoğlu B.D., Lesniak N.A., Ruffin M.T. 4th, Schloss P.D. Fecal short-chain fatty acids are not predictive of colonic tumor status and cannot be predicted based on bacterial community structure. mBio. 2019; 10(4): e01454-19.

14. Андрющенко С.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В., Бекпергенова А.В. Генетическая характеристика адаптивного потенциала бифидобактерий биотопа дистального отдела кишечника человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(4): 4–11. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-4-4-11

15. Davis KM, Weiser JN. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 2011; 79(2): 562–70. https://doi.org/10.1128/IAI.00651-10.


Об авторах

О. В. Бухарин
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Оренбургского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Россия

Бухарин Олег Валерьевич — д.м.н., академик РАН, научный руководитель

Оренбург



С. В. Андрющенко
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Оренбургского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Россия

Андрющенко Сергей Валерьевич — к.м.н., с.н.с. лаб. биомониторинга и молекулярно-генетических исследований

Оренбург



Н. Б. Перунова
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Оренбургского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Россия

Перунова Наталья Борисовна — д.м.н., проф. РАН, в.н.с. (с исполнением обязанностей зав. лаб.) лаб. биомониторинга и молекулярно-генетических исследований

Оренбург



Е. В. Иванова
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Оренбургского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Россия

Иванова Елена Валерьевна — д.м.н., доц., в.н.с. лаб. биомониторинга и молекулярно-генетических исследований

Оренбург



Просмотров: 184


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)