Preview

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии

Расширенный поиск

Влияние иммуномодуляции на внутриклеточную экспрессию цитокинов Т-хелперами селезёнки мышей, иммунизированных Yersinia pestis ЕV НИИЭГ

https://doi.org/10.36233/0372-9311-28

Полный текст:

Аннотация

Цель работы — охарактеризовать внутриклеточную экспрессию цитокинов Т-хелперами селезенки и спонтанную продукцию цитокинов в крови мышей линии BALB/c, иммунизированных Yersinia pestis ЕV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции.

Материалы и методы. Внутриклеточную экспрессию CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ определяли в суспензии клеток селезенки мышей методом проточной цитометрии, а IFN-γ и IL-10 — в супернатантах крови методом иммуноферментного анализа на 3-и и 21-е сутки после иммунизации Y. pestis ЕV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции. Заражение животных Y. pestis 231 в дозе 400 LD50 проводили на 21-е сутки после иммунизации.

Результаты. Выявлены различия в цитокиновом ответе при введении исследуемых препаратов, коррелирующие с уровнем CD4+IFN-γ+ у животных. Так, на 3-и сутки установлено достоверное снижение CD4+IFN-γ+ при введении Y. pestis EV НИИЭГ и препарата рекомбинантного γ-интерферона (ингарон). В ответ на применение вакцинного штамма с азоксимером бромида (полиоксидоний) регистрировали значимое повышение CD4+IFN-γ+. На 21-е сутки внутриклеточная экспрессия всех исследуемых цитокинов IFN-γ, IL-4 и IL-17 увеличивалась в среднем в 2,3 раза при использовании иммуномодуляторов в схеме иммунизации. Кроме того, на 21-е сутки регистрировали достоверное (p ˂ 0,05) увеличение доли Т-хелперов, экспрессирующих IFN-γ, а также уровня спонтанной продукции IFN-γ в супернатантах крови только у животных, иммунизированных с применением схем, включающих иммуномодуляторы. При заражении Y. pestis 231 животных, предварительно иммунизированных в сочетании с полиоксидонием, методом корреляционного анализа подтверждена связь (r = 0,94; р = 0,0004) выживаемости мышей c интенсивностью экспрессии CD4+IFN-γ+.

Заключение. Полученные данные подтверждают эффективность применения полиоксидония в схемах иммунизации экспериментальных животных Y. pestis EV НИИЭГ и информативность оценки степени протекции, создаваемой иммунизацией, по результатам внутриклеточной экспрессии цитокинов.

Введение

Применение иммуномодуляторов — это один из способов воздействия на реактивность клеток иммунной системы для повышения эффективности вакцинации, в том числе против чумы [1]. В России зарегистрирован ряд веществ, обладающих иммуномодулирующими и адъювантными свойствами, охарактеризован их иммуномодулирующий потенциал. Так, адъювантные свойства азоксимера бромида (полиоксидоний, ПО) и рекомбинантного интерферона-гамма (IFN-γ, ингарон) используют в составе различных вакцин [2]. Экспериментально доказан модулирующий эффект ПО при сочетанном применении с Yersinia pestis ЕV НИИЭГ, выражающийся в стимуляции процесса антителообразования, повышении эффективности протективных характеристик вакцинного штамма и в снижении его цитотоксического воздействия на иммунную систему биомоделей [3–6].

В зависимости от набора секретируемых цитокинов, факторов транскрипции и путей передачи сигналов эффекторные CD4+-T-хелперные лимфоциты подразделяются на Th1-, Th2-, Th9-, Th17-, Th22- и Tfh-субпопуляции [7]. В защите организма от инфекции важную роль играют продуцируемые Т-клетками цитокины, которые, например, в виде рекомбинантных препаратов широко используют в качестве адъювантов и для повышения эффективности специфической профилактики против ряда инфекционных заболеваний, включая чуму [2].

Определение содержания цитокинов в активированных Т-клетках и биологических жидкостях проводят для оценки эффективности защиты в модельных экспериментах при разработке вакцин против чумы и для оценки выраженности противочумного иммунитета [8, 9]. Если концентрация цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях показывает текущее состояние иммунной системы, определение уровня продукции цитокинов мононуклеарами крови отражает функциональное состояние клеток (спонтанная продукция) или их потенциальную способность отвечать на антигенный стимул (индуцированная продукция), то метод внутриклеточного окрашивания цитокинов дает возможность, применяя проточную цитофлюориметрию, определять популяционную принадлежность клеток, продуцирующих тот или иной цитокин [10].

Определение экспрессии цитокинов в стимулированных in vitro специфическим антигеном Т-лимфоцитах-хелперах применяли при клинических испытаниях вакцин против туберкулёза, менингита и малярии [10, 11], для оценки клеточного ответа у мышей, иммунизированных антигенами чумного микроба [12].

Цель работы — охарактеризовать внутриклеточную экспрессию цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-17) Т-хелперами селезенки и спонтанную продукцию цитокинов (IFN-γ, IL-10) в супернатантах крови мышей линии BALB/c, иммунизированных Yersinia pestis ЕV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции.

Материалы и методы

В работе использовали вакцинный (Y. pestis EV НИИЭГ) и вирулентный (Y. pestis 231) штаммы чумного микроба, полученные из «Государственной коллекции патогенных бактерий» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Культуру Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) в течение 48 ч при 28 ± 1ºС. Взвесь Y. pestis с концентрацией 10КОЕ готовили в 0,9% растворе NaCl рН 7,2 по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85П. Методом последовательных разведений доводили концентрацию клеток до 1 × 10КОЕ. Фактическое содержание микробных клеток в 0,1 мл взвеси контролировали путем высева на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера.

Экспериментальной моделью служили 270 мышей линии BALB/c массой 20 ± 5 г, полученные из отдела экспериментальных животных с виварием РосНИПЧИ «Микроб». Мыши были разделены на 3 опытных и контрольную группы (табл. 1).

Таблица 1. Схема исследования*
Table 1. Study design*


Примечание. *Все этапы исследования выполнялись в 3 повторах.

Note. *All steps of the study were performed in 3 repetitions.

Животных 1-й группы подкожно иммунизировали 2-суточной культурой Y. pestis EV НИИЭГ в концентрации 2,5 × 10КОЕ. Мышам 2-й группы за 1 ч до иммунизации вводили ингарон («Фармаклон») в дозе 150 МЕ, а 3-й группы — ПО («ПетроваксФарм») в дозе 4 мкг. Контрольную группу (4-ю) составили интактные мыши.

Работу с животными проводили в соответствии с международными принципами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» ETS N 123 (Страсбург, 1986), Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», положительным заключением Этического комитета при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 1 от 15.01.2019).

Мышей выводили из эксперимента на 3-и и 21-е сутки иммуногенеза, выделяли кровь и селезёнку. По общепринятому методу готовили взвесь клеток селезенки в концентрации 10клеток/мл в среде RPMI-1640 с гентамицином (100 мкг/мл). Для определения процентного содержания Т-хелперов и доли клеток, положительных по экспрессии IFN-γ, IL-4, IL-17, использовали коммерческий набор «Mouse Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kit» («BD Biosciences»), который применяли в соответствии с инструкцией производителя. Готовые окрашенные клеточные суспензии анализировали на проточном цитофлюориметре «BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer» («Becton Dickinson»). Методом проточной цитометрии во взвесях клеток селезенки по параметрам светорассеяния (размеру и степени гранулярности) дифференцировали лимфоциты и фагоциты, чтобы определить в исследуемых образцах соотношение лимфоцитов и клеток врождённого иммунитета [4].

Гепаринизированную мышиную кровь разводили в соотношении 1 : 4 средой RPMI-1640 с 100 мкг/мл гентамицина. Образцы инкубировали в течение 24 ч при 37ºС, затем осаждали центрифугированием при 300g в течение 15 мин, отбирали супернатанты. Спонтанную продукцию цитокинов определяли в супернатантах крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов для определения IFN-γ и IL-10 («eBioscience»). Исследования выполняли на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Lazurit» («Dynex Technologies») при длине волны 450 нм.

На 21-е сутки иммуногенеза часть животных заражали Y. pestis 231 в дозе 400 LD50 (3600 КОЕ). За зараженными животными наблюдали в течение 21 сут. Результат оценивали по количеству выживших животных.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2016», «Statistica v.10.0» («StatSoft Inc.»). Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Данные представляли в виде средней и средней квадратической ошибки средней арифметической.

Результаты и обсуждение

Основными клетками селезенки мышей были лимфоциты, доля которых изменялась в диапазоне 71–85%. Лишь у мышей 3-й группы на 21-е сутки иммуногенеза отмечали достоверное (p ˂ 0,05) снижение общего количества лимфоцитов по отношению к интактным животным, но при этом регистрировали заметное увеличение среди них доли Т-хелперов (табл. 2). В то же время во 2-й группе на 3-и сутки после иммунизации отмечали на фоне 85,8% лимфоцитов снижение доли Т-хелперов до 29,1% (в контроле 34,6%). В целом значимого влияния применённых схем иммунизации на субпопуляционный состав лимфоцитов крови не выявлено.

Таблица 2. Влияние иммуномодуляторов на показатели клеточного иммунитета мышей линии BALB/c, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ (M ± m)
Table 2. The effect of immunomodulators on the cellular immunity of BALB/c mice immunized with Y. pestis EV NIIEG (M ± m)


Примечание. *р ˂ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *p ˂ 0,05 compared to control.

При оценке внутриклеточной экспрессии IFN-γ Т-хелперами селезенки у иммунизированных мышей установлено, что уже на 3-и сутки отмечается статистически значимое (p ˂ 0,05) увеличение доли CD4+IFN-γ-клеток (табл. 2), исключением была реакция животных во 2-й группе, где этот показатель был в 1,5 раза ниже (p ˂ 0,05), чем в контрольной группе. Возможно, такая реакция Т-хелперов у мышей, иммунизированных Y. pestis в сочетании с ингароном, обусловлена повышением секреции цитокина во внеклеточное пространство. В пользу этого положения свидетельствуют данные по значительному увеличению спонтанной продукции IFN-γ мононуклеарами крови (до 78,8 пг/мл), выявленному методом ИФА.

К 21-м суткам наблюдения регистрировали достоверное (p ˂ 0,05) увеличение доли Т-хелперов, экспрессирующих IFN-γ, а также уровня спонтанной продукции IFN-γ в супернатантах крови только у животных, иммунизированных с применением схем, включающих иммуномодуляторы.

На 3-и сутки иммуногенеза применённые схемы иммунизации отличались и по реакции CD4+IL-4+. Так, если у мышей в 1-й группе экспрессия IL-4была выше в 1,7 раза, чем у интактных животных, а во 2-й группе — в 2 раза ниже, то в 3-й группе регистрировали реакцию на уровне контроля. К 21-м суткам после иммунизации только в группах мышей, иммунизированных в сочетании с иммуномодуляторами, отмечали достоверное увеличение доли CD4+IL-4+-клеток.

На 3-и сутки после иммунизации аналогичная тенденция была прослежена и относительно CD4+IL17-клеток. Доля Т-хелперов, синтезирующих IL-17, достоверно (p ˂ 0,05) повышалась во всех трёх опытных группах только на 21-е сутки иммуногенеза. В этот период у мышей, привитых живой чумной вакциной, формируется, как известно, наиболее напряжённый противочумный иммунитет [4].

Из полученных данных следует, что применённые схемы иммунизации мышей отличались по своей реакции со стороны CD4+IFN-γ+-, CD4+IL-4+-, CD4+IL-17+- клеток преимущественно в нестерильной фазе формирования противочумного иммунитета.

Отсутствие ингибирующего эффекта на внутриклеточное накопление IFN-γ в Т-хелперах на ранней стадии иммуногенеза при включении в схемы иммунизации ПО укладывается в ранее выявленную способность этого иммуномодулятора стимулировать как раннюю фазу антигенспецифического противочумного иммунного ответа, ускоряя появление и исчезновение лимфоцитов с рецепторами к капсульному антигену (F1) Y. рestis, так и его эффекторную фазу, способствуя более раннему развитию антительного ответа [5].

Максимальное увеличение показателей CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+, зарегистрированное в 3-й группе на 21-е сутки (p ˂ 0,05), возможно, объясняется комплементарным действием IL-17 и IFN-γ, что согласуется с данными зарубежных исследователей, продемонстрировавших синергическое участие этих цитокинов в координации антимикробного потенциала нейтрофилов и макрофагов в защите от острой легочной чумы [13]. Кроме того, способность ПО повышать уровень экспрессии IFN-γ в T-хелперах свидетельствует о формировании в организме приобретённого поствакцинального иммунитета, оцениваемого по изменению продукции именно этого цитокина [14].

При анализе взаимосвязи относительных количеств CD4+-Т-хелперов, синтезирующих цитокины, с общим содержанием CD3CD4-клеток в процессе иммуногенеза выявлен ряд корреляционных связей: в 1-й группе — для CD4IFN-γ+ и CD4+IL-17(r = 0,83–0,88; р = 0,04), а во 2-й группе — для CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17+ (r = 0,83–0,94; р = 0,02).

Нормальное функционирование иммунной системы строится на балансе Th1- и Th2-клеток, обусловленном продукцией этими клетками определенных регуляторных цитокинов. Для характеристики направленности сдвига функционального баланса в системе Th1/Th2-клеток сравнили изменение соотношения в культуре спленоцитов — CD4+IFN-γ+/CD4+IL-4и в супернатантах крови — Th1- и Th2-ассоциированных цитокинов (IFN-γ/ IL‑10). Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что во всех опытных группах соотношение CD4+IFN-γ+/CD4+IL-4+ было значимо больше 1,0 и превышало аналогичный показатель у интактных мышей, что подтверждало популяционное превалирование активированных Th1-клеток у животных, иммунизированных против чумы. В то же время, ориентируясь только на оценку функционального состояния мононуклеаров по спонтанной продукции Th1- и Th2-ассоциированных цитокинов в супернатантах крови, можно не вполне адекватно оценить факт снижения соотношения IFN-γ/IL-10, трактуя его как смещение в сторону Th2-ответа. В комплексе характеристика как популяционной принадлежности активированных клеток, так и их функционального состояния позволяет более точно определять направленность иммунологических реакций у иммунизированных животных.

Таблица 3. Коэффициенты соотношений Th1- и Th2-клеток и ассоциированных с ними цитокинов (M ± m)
Table 3. Ratios of Th1 cells to Th2 cells and their associated cytokines (M ± m)


Примечание. *р ˂ 0,05 по сравнению с контролем.

Note. *p ˂ 0,05 compared to control.

На 21-е сутки после иммунизации Y. pestis EV НИИЭГ в концентрации 2,5 × 10КОЕ, а также в сочетании с иммуномодуляторами по 10 животных из каждой группы заражали подкожно 400 LD50 вирулентного штамма Y. pestis 231. Наблюдение за мышами проводили в течение 21 сут, учитывая количество выживших животных в группах. Установлено, что в 1-й группе выжили 9 животных при средней продолжительности жизни 5,1 ± 0,4 дня, во 2-й — 3 животных при средней продолжительности жизни 5,5 ± 0,4 дня, а в 3-й группе все животные оставались живы в течение всего срока наблюдения.

Затем был проведен корреляционный анализ между показателями выживаемости животных в группах и уровнем внутриклеточной экспрессии изучаемых цитокинов. Выявлена высокая степень прямой связи (r = 0,94; р = 0,0004) между количеством выживших животных и повышением доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих IFN-γ у мышей из 3-й группы, что подтверждает имеющиеся сведения об определяющей роли IFN-γ в эффективности клеточного иммунного ответа [15].

В то же время меньшая эффективность сочетанного применения Y. pestis с ингароном, сопровождающаяся снижением доли СD4+ и СD4+IFN-γв нестерильной фазе формирования иммунного ответа, по-видимому, можно объяснить возможностью использования рекомбинантного человеческого IFN-γ бактериальными клетками вакцинного штамма для индукции апоптоза Т-клеток у мышей как одного из механизмов уклонения патогена от реакций иммунной системы [15].

Установленный факт увеличения доли CD4+IFN-γ-лимфоцитов в 2,7 раза по сравнению с интактными животными и корреляции эффективности экспрессии IFN-γ Т-клетками иммунной системы мышей с их выживаемостью при заражении вирулентной культурой чумного микроба позволяет сделать вывод о перспективности применения ПО в схемах вакцинации против чумы. Это согласуется с ранее полученными нами данными о стимулирующем фагоцитарную и цитокин-продуцирующую активность лейкоцитов крови по отношению к чумному микробу потенциале ПО [8]. Иммуномодулирующий эффект ингарона оказался не достаточным для формирования напряжённого иммунитета у экспериментальных животных.

Таким образом, современные представления о механизмах действия иммуномодуляторов в сочетании с новыми экспериментальными данными, полученными при выполнении настоящей работы, позволили подтвердить эффективность применения именно ПО в схемах иммунизации экспериментальных животных вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ и информативность оценки степени протекции, создаваемой иммунизацией, по результатам внутриклеточной экспрессии цитокинов Т-хелперами селезенки.

Список литературы

1. Verma S.K., Tuteja U. Plague vaccine development: current research and future trends. Front. Immunol. 2016; 7: 602. https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00602

2. Омельченко Н.Д., Иванова И.А., Беспалова И.А., Филиппенко А.В. Иммуномодуляторы и специфическая профилактика инфекционных болезней. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (3): 21–6. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-3-21-2

3. Бугоркова С.А., Курылина А.Ф., Щуковская Т.Н. Морфофункциональная характеристика иммунокомпетентных органов мышей линии Balb/c при иммунизации вакцинным штаммом Yersinia pestis EV НИИЭГ на фоне иммуномодуляции. Проблемы особо опасных инфекций. 2017; (2): 58–62. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2017-2-58-62

4. Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Модулирующий эффект полиоксидония на реактивность клеток иммунной системы при формировании противочумного иммунитета. Иммунология. 2016; 37(6): 320–5. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-320-325

5. Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Тугамбаев Т.И., Атшабар Б.Б., Денисова Т.Г. и др. Влияние полиоксидония на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины. Иммунология. 2014; 35(5): 286–90.

6. Щуковская Т.Н., Курылина А.Ф., Шавина Н.Ю., Бугоркова С.А. Влияние полиоксидония, Poly(I:C), даларгина на защитное действие вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ при экспериментальной чуме. Российский иммунологический журнал. 2020; 23(1): 41–50. https://doi.org/10.15789/1028-7221-005-IOP

7. Костарева О.С., Габдулхаков А.Г., Коляденко И.А., Гарбер М.Б., Тищенко С.В. Интерлейкин-17: функциональные и структурные особенности; использование в качестве терапевтической мишени. Успехи биологической химии. 2019; 59: 393–418.

8. Клюева С.Н., Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Кожевников В.А., Гончарова А.Ю. Фагоцитарная и цитокин-продуцирующая активность лейкоцитов крови мышей линии Balb/c, привитых против чумы на фоне иммуномодуляции полиоксидонием. Российский иммунологический журнал. 2019; 13(4): 1412–20. https://doi.org/10.31857/S102872210007044-3

9. Parent M.A., Wilhelm L.B., Kummer L.W., Szaba F.M., Mullarky I.K., Smiley S.T. Gamma interferon, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide synthase 2, key elements of cellular immunity, perform critical protective functions during humoral defense against lethal pulmonary Yersinia pestis infection. Infect. Immun. 2006; 74(6): 3381–6. https://doi.org/10.1128/iai.00185-06

10. Smith S.G., Smits K., Joosten S.A., Meijgaarden K.E., Satti I., Fletcher H.A., et al. Intracellular cytokine staining and flow cytometry: Considerations for application in clinical trials of novel tuberculosis vaccines. PLoS One. 2015; 10(9): e0138042. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138042

11. Flaxman A., Ewer K.J. Methods for measuring T-cell memory to vaccination: from mouse to man. Vaccines (Basel). 2018; 6(3): 43. https://doi.org/10.3390/vaccines6030043

12. Leal E.A., Moreira J.D., Nunes F.F., Souza L.R., Martins J.M., Toledo V.P.C., et al. Humoral and cellular immune response of mice challenged with Yersinia pestis antigenic preparations. Braz. J. Infect. Dis. 2017; 21(6): 620–6. https://doi.org/10.1016/j.bjid.2017.09.001

13. Bi Y., Zhou J., Yang H., Wang X., Zhang X., Wang Q., et al. IL-17A produced by neutrophils protects against pneumonic plague through orchestrating IFN-γ-activated macrophage programming. J. Immunol. 2014; 192(2): 704–13. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1301687

14. Бугоркова С.А., Щуковская Т.Н., Микшис Н.И., Клюева С.Н., Кудрявцева О.М., Кравцов А.Л. и др. Комплексное иммунологическое исследование вакцинированных живой чумной вакциной лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного очага чумы в Республике Калмыкия. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(3): 38–49. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-3-38-50

15. Луцкий А.А., Жирков А.А., Лобзин Д.Ю., Рао М., Алексеева Л.А., Мейрер М. и др. Интерферон-γ: биологическая функция и значение для диагностики клеточного иммунного ответа. Журнал инфектологии. 2015; 7(4): 10–22. https://doi.org/10.22625/2072-6732-2015-7-4-10-22


Об авторах

С. Н. Клюева
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

Клюева Светлана Николаевна — кандидат биологических наук, научный сотрудник отделения иммунологии

 Саратов



А. Ю. Гончарова
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

Гончарова Анастасия Юрьевна — кандидат медицинских наук, научный сотрудник отделения 

Саратов



А. Л. Кравцов
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

Кравцов Александр Леонидович — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отделения иммунологии

 Саратов



С. А. Бугоркова
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Россия

Бугоркова Светлана Александровна — доктор медицинских наук, исполняющая обязанности заведующего отделения иммунологии

Саратов



Просмотров: 114


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0372-9311 (Print)
ISSN 2686-7613 (Online)